纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A培养条件的优化

苟 欢 王 莉 范一婷 贺新生 袁小红

纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A培养条件的优化

苟 欢 王 莉 范一婷 贺新生 袁小红*

（西南科技大学生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010）

为优化纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A的固体培养和液体培养条件，采用高效液相色谱法，测定分析固体培养培养料不同棉籽壳与麦麸比例配方，及液体培养不同碳源、氮源和培养时间的环肽Xylastriamide A含量差异。结果：固体培养，以培养料中的棉籽壳/麦麸比为70/30时，子实体的环肽Xylastriamide A含量较高，达578.20 μg/g；液体培养，最佳碳源和最佳氮源分别为麦芽糖和酵母浸出粉，培养14天得到的菌丝球环肽Xylastriamide A含量分别达到9.77 μg/g和19.95 μg/g。

纵条纹炭角菌；高效液相色谱法；固体培养；液体培养

纵条纹炭角菌（），隶属于子囊菌亚门、炭角菌科、炭角菌属，广泛分布在广西、四川、贵州、海南等地区[1]。本课题组对纵条纹炭角菌进行多年研究，发现其具有抗菌[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、改善睡眠[5]等药理活性。已有学者对纵条纹炭角菌子实体成分及其效应进行研究[6-10]，雷传文等[10, 11]采用HPLC半制备方法分离得到新的环肽Xylastriamide A，并通过体外药理活性试验，发现Xylastriamide A具有显著的抗肿瘤活性，在浓度为40 μmoL/L时对肿瘤细胞株的抑制率超过65%，对秀丽隐杆线虫也有一定的抗虫活性，其IC50值为103.54 μg/mL。为进一步研究和开发这类新的环肽Xylastriamide A成分，在前期试验所得的纵条纹炭角菌子实体最适培养条件[12]和菌丝最适液体培养条件[13]的基础上，我们通过测定不同培养条件下环肽Xylastriamide A的含量，对其环肽Xylastriamide A的培养条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 设备与材料

（2）试剂。环肽Xylastriamide A对照品（实验室自制）；乙腈，色谱纯（塞默飞世尔科技有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

（1）固体培养试验。设9种培养料配方，其棉籽壳/麦麸比分别为100/0，95/5，90/10，85/15，80/20，75/25，70/30，65/35，60/40，加水量为棉籽壳和麦麸总量的1.3倍[14]。按不同比例配方得到的纵条纹炭角菌子实体分别标记为样品a、b、c、d、e、f、g、h、i。每种配方设3个重复，以防接种后有污染。

取36个罐头瓶，将配制好的培养料装罐，每瓶装料重50 g，120 ℃高压灭菌1 h。待罐头瓶冷却后，在超净工作台上接种。为便于后期观察菌丝生长情况，接种方法为在培养料紧挨瓶壁处挖一个小孔，接入1 cm2左右的菌种。接种完成后放入25 ℃恒温箱中培养55天。将培养得到的纵条纹炭角菌子实体从瓶中摘下。记录每配方子实体数量、鲜重，三次测其长度取平均值后，置于60 ℃烘干箱内干燥24 h，测得干重，并进行检测。

（2）液体培养试验。液体基础培养基配方：葡萄糖4%，蛋白胨0.4%，硫酸镁0.15%，磷酸二氢钾0.3%[13]，pH自然。配制540 mL培养基，均匀分装至9个100 mL的锥形瓶中，每瓶装60 mL，基础培养基设3次重复。碳源试验配方：仅改变液体基础培养基中的碳源葡萄糖为乳糖、蔗糖、麦芽糖。氮源试验配方：仅改变液体基础培养基中的氮源蛋白胨为黄豆饼粉、酵母浸出粉。

采用高压蒸汽灭菌锅灭菌，121 MPa下保持30 min。灭菌完毕后取出培养基，放置在超净工作台上，待冷却至常温后按无菌操作进行接种。接种步骤：选取生长良好的试管菌种，点燃酒精灯，将接种环在酒精灯下灼烧灭菌，冷却后取1 cm左右的菌种块接入锥形瓶中。接种完成后，于30 ℃、转速120 r/min下振荡培养。收集培养13天、14天、15天的菌丝球，将发酵液过滤分离，置于60 ℃干燥箱内干燥12 h，测其干重。由于在预试验中已经确定培养液不含环肽Xylastriamide A，因此直接检测菌丝球。

1.3 检测波长的确定

对环肽Xylastriamide A对照品在200～400 nm范围内进行紫外检测，结果在254 nm处有最大吸收峰，故本试验选择254 nm为检测波长。

1.4 色谱条件

1.5 对照品溶液的制备

精确称取纵条纹炭角菌环肽，加乙腈溶解配置成3.5 μg/mL、5 μg/mL、7 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、70 μg/mL的对照品。

1.6 供试品溶液的制备

（1）固体培养的供试样品制备。将固体培养得到的纵条纹炭角菌子实体制成供试样品溶液，由于培养料配方不同及有部分培养罐被污染，导致各配方产量不一致。精确称取样品a为2.00 g、b为2.00 g、c为5.00 g、d为4.10 g、e为5.10 g、f为6.19 g、g为3.04 g、h为4.05 g、i为4.12 g，为使培养得到的子实体利用最大化，将其置于锥形瓶中，按照1∶10加入乙醇摇匀静置浸提3 h，过滤，再将滤渣按上述方法重新浸提2次，共9 h。将滤液倒入旋蒸瓶内，50 ℃水浴旋蒸蒸发乙醇至样品呈浸膏状，再按质量比1∶4加入水，溶解浸膏。加入相同量的二氯甲烷萃取，重复3次，得到含环肽的萃取液[8]。

将萃取液倒至旋蒸瓶中，50 ℃水浴旋蒸蒸发乙醇至样品呈浸膏状，再加1 mL甲醇进行溶解，置于离心管中，0.45 μm微孔滤膜过滤，去滤液作为固体供试样品溶液。

（2）液体培养的供试样品制备。将液体培养的菌丝球干燥后精确称重，置于锥形瓶中，按照1∶10加入甲醇摇匀静置浸提3 h，过滤，再将滤渣按上述方法重新浸提2次，共9 h。由于菌丝球产量远少于子实体，因此未用二氯甲烷萃取除杂，以避免萃取过程增加环肽Xylastriamide A的损失。

将滤液旋蒸成浸膏，再直接加甲醇溶解至离心管1 mL处，0.45 μm微孔滤膜过滤，去滤液作为液体供试样品溶液。

2 结果与分析

2.1 固体培养的子实体生长情况

由表1可知，各配方生物学效率，以棉籽壳/麦麸比75/25为最高，达13.73%；90/10、80/20、60/40配方也较高；全部为棉籽壳的配方生物学效率最低，仅为4.45%。

表1 不同固体培养料配方的子实体生长比较

2.2 线性关系考察

分别取纵条纹炭角菌环肽对照品溶液3.5 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL各20 μL进样，测定对照品溶液吸收峰峰面积（图1）。以质量浓度（）为横坐标，峰面积（）为纵坐标进行线性回归，得回归方程=21.122– 61.954（2=0.9838，n=5）（图2）。表明纵条纹炭角菌环肽线性关系良好。

图1 环肽Xylastriamide A对照品色谱图

图2 环肽标准曲线

2.3 固体培养中不同棉籽壳/麦麸比对环肽Xylastriamide A含量的影响

通过高效液相色谱法测定固体培养子实体的环肽Xylastriamide A含量（表2），结果以固体培养料中的棉籽壳/麦麸比为70/30时，子实体的环肽含量较高，达578.20 μg/g，不同棉籽壳/麦麸比处理的平均环肽含量为153.19 μg/g。

表2 固体培养的纵条纹炭角菌环肽XylastriamideA含量

注：a～i表示不同比例配方固体培养得到的子实体样品，j表示野生纵条纹炭角菌。

2.4 液体培养中不同碳源、氮源及培养时间对环肽Xylastriamide A含量的影响

通过高效液相色谱法测定，由峰面积等数据得到液体培养菌丝球环肽Xylastriamide A含量。结果（表3）表明，液体培养中以酵母粉为氮源培养14天的菌丝球环肽含量较多，为19.95 μg/g；以麦芽糖为碳源培养14天的菌丝球环肽含量较多，为9.77 μg/g。检测培养15天的酵母浸出粉、葡萄糖培养基的菌丝球环肽含量为0。这可能是由于环肽被全部降解所致。所有液体培养基配方处理的环肽含量均在第14天达到峰值，之后都有不同程度的降解。

表3 液体培养的纵条纹炭角菌环肽Xylastriamide A含量

在液体培养过程中发现培养基有不同程度的污染，其中以黄豆饼粉为氮源的培养基污染最为严重，原因可能是黄豆饼粉没有经过熬制，灭菌不够彻底等，因此弃用。其他液体培养基也有轻度污染，可能是因接种等环节操作不当所致。

3 讨 论

本研究为提高纵条纹炭角菌中环肽Xylastriamide A的含量，探索其优化培养条件。试验结果表明，固体培养不同棉籽壳/麦麸料比例配方的环肽含量有较大差异，以棉籽壳/麦麸比为70/30时环肽含量较高，达578.20 μg/g。培养料中的麸皮占比对子实体环肽含量的影响较大。液体培养条件优化试验结果：最佳氮源为酵母浸出粉，最佳碳源为麦芽糖。各液体培养基配方处理均在第14天达到峰值，之后都有不同程度的降解，尤其酵母浸出粉和葡萄糖配方处理的菌丝球在第15天时检测不到环肽。这是否与液体培养温度、培养时间、检测时间、检测线等有关，需要进一步研究。

与液体培养相比，固体培养所得的子实体环肽Xylastriamide A含量更高。其含量高低可能与生长发育阶段有很大关系。但液体培养时间比固体培养时间短很多，因此更适合用于生产。后期可以加大液体培养，设计最佳方案以获取更多的环肽Xylastriamide A，为后续生物活性研究奠定基础。

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Optimization of culture conditions of cyclopeptide Xylastriamide A in

Gou Huan Wang Li Fan Yiting He Xinsheng Yuan Xiaohong*

（School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science And Technology, Mianyang, Sichuan 621010, China）

The content of cyclopeptide Xylastriamide A inwas increased by optimizing the culture conditions. Determination of cyclopeptide Xylastriamide A inby HPLC. The solid culture materials were optimized, and the content of cyclopeptide Xylastriamide A in different ratios of cottonseed hull and wheat bran of culture medium formulas were compared; and the liquid culture which was based on the basic mediumwas to compare the content of cyclopeptide Xylastriamide A in different carbon sources, nitrogen sources and culture time. The results showed that when the ratio of cottonseed hull to wheat bran was 70∶30 in culture medium formula, the content of cyclopeptide Xylastriamide A in fruiting body was as high as 578.20 μg/g. In liquid culture, The best carbon source and nitrogen source were maltose and yeast powder, the Xylastriamide A content of mycelium after 14 days of culture was 9.77 μg/g and 19.95 μg/g, respectively.

; HPLC; solid culture; liquid culture

S646，R285

B

2095-0934（2020）05-309-05

国家自然科学基金项目（21272189）；四川省大学生创新创业训练计划资助项目（201810619088）；中国国家转基因重大专项（2019ZX08010-004）

苟欢（1998—），女，四川南充人，研究方向为天然产物化学。E-mail：1203522826@qq.com。

袁小红，博士，教授，研究方向为天然药物和保健食品。E-mail：419225263@qq.com。