基于SDF-1/CXCR4信号轴研究肺复方对肺癌A549细胞侵袭能力的影响

谭小宁，朱克俭，蒋益兰，罗吉，罗燕，吕元，马思静，李勇敏

基于SDF-1/CXCR4信号轴研究肺复方对肺癌A549细胞侵袭能力的影响

谭小宁，朱克俭，蒋益兰，罗吉，罗燕，吕元，马思静，李勇敏

湖南省中医药研究院附属医院，中医肿瘤学湖南省重点实验室，抗肿瘤中药创新平台，湖南 长沙 410006

观察肺复方对肺癌A549细胞侵袭能力的影响，从SDF-1/CXCR4生物轴调控角度探讨其作用机制。实验分为空白血清组（正常血清培养基）和肺复方低、中、高剂量组（分别加入5%、10%、15%肺复方药物血清培养基），各组加入基质衍生因子1（SDF-1）处理48 h，Transwell检测A549细胞侵袭能力，Western blot检测A549细胞SDF-1特异受体CXCR4、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）蛋白表达，RT-PCR检测A549细胞E-cadherin、Vimentin和CXCR4基因表达。与空白血清组比较，肺复方低、中、高剂量组A549细胞体外侵袭能力明显下降（＜0.01）；与空白血清组比较，肺复方低、中、高剂量组A549细胞CXCR4、PI3K、Akt、p-Akt和Vimentin蛋白表达均有一定程度下降，E-cadherin蛋白表达上调，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01），肺复方低、中、高剂量组A549细胞CXCR4、Vimentin mRNA表达下调，肺复方中、高剂量组A549细胞E-cadherin mRNA表达上调，差异均有统计学意义（＜0.05，＜0.01）。肺复方能抑制A549细胞侵袭能力、上皮间质转化进程，其作用机制可能与SDF-1/CXCR4生物轴调控PI3K-Akt通路有关。

肺癌；肺复方；SDF-1/CXCR4生物轴；上皮间质转化；A549细胞

统计数据显示，肺癌是我国发病率、死亡率第一的癌症[1]。非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）最为常见，约占所有肺癌的85%，NSCLC分为腺癌、鳞癌和大细胞癌3种类型，由于缺乏特征性症状，大部分NSCLC患者在确诊时己属中晚期，常失去手术机会[2]。肺癌转移是致死的主要原因之一，肿瘤微环境是肿瘤细胞的生存场所，在促进肿瘤转移中具有关键作用，肿瘤微环境中基质细胞能旁分泌大量细胞因子促进肿瘤细胞的侵袭和转移[3]。肿瘤微环境中基质细胞分泌趋化因子CXCL12又称基质衍生因子-1（SDF-1）[4]，其受体CXCR4在正常组织低表达，在肺腺癌组织高表达，高表达CXCR4肺癌患者更易发生转移[5-6]。中医药能改善肺癌患者症状、长期稳定肿块、一定程度上防治肺癌的复发与转移，达到延长生存期的目的[7-8]。湖南省中医药研究院附属医院经验方肺复方长期临床应用表明，其能延长肺癌患者生存期，提高患者生活质量，减轻临床症状[9-10]。本研究采用高表达CXCR4受体的肺腺癌A549细胞，从SDF-1/CXCR4生物轴调控角度探讨肺复方对A549转移能力的影响。

1 实验材料

1.1 细胞株

人肺癌A549细胞，购于中国科学院细胞库，目录号TCHu150。

1.2 动物

雄性SD大鼠50只，SPF级，体质量180～200 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号43004700029438。动物饲养于湖南省中医药研究院实验动物中心，温度22～26 ℃、相对湿度40%～70%，自由摄食饮水。

1.3 药物

肺复方[白参（蒸兑）10 g，茯苓10 g，灵芝10 g，黄芪20 g，法半夏9 g，川贝母8 g，麦冬10 g，百合 15 g，枸杞子10 g，白芍10 g，桔梗10 g，三七粉3 g，臭牡丹20 g，半枝莲20 g，白花蛇舌草20 g，甘草5 g]，饮片均购自湖南省中医药研究院附属医院中药房，并由制剂科按比例水煎浓缩后制成膏剂，按临床等效剂量配制成含原药材1.7 g/mL。

1.4 主要试剂与仪器

RPMI培养基（Hyclone公司，批号AD18379269），0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，批号SH30042），PBS（Hyclone公司，批号AC12557265），胎牛血清（美国Gibco公司，批号1640958），ECL发光液（Thermo，批号SF249787B），磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K，货号20584-1-AP）、蛋白激酶B（Akt，货号60203-2-Ig）、p-Akt（货号66444-1-AP）、E-钙黏蛋白（E-cadherin，货号20874-1-AP）、波形蛋白（Vimentin，货号10366-1-AP）、CXCR4（货号11073-1-AP）、β-actin（货号60008-1-Ig）均购自Proteintech公司，SDF-1（美国R&D公司，350-NS-010），Transwell小室（Costar 3422，24孔，孔径8.0 μm）cDNA反转录试剂盒（Takara公司，批号RR047A），SYBR Green PCR试剂盒（Takara公司，批号RR820A）。化学发光成像系统（GENE公司，型号G：BOX ChemiXRQ），荧光正置显微镜（德国Leica公司，型号DM4000），二氧化碳孵箱（美国Thermo Fisher，型号3141型），高速离心机（卢湘仪，型号TGL-18M），微量核酸蛋白浓度分析仪（英国BioDrop公司，型号BioDrop Duo），电泳仪（美国Bio-Rad，型号powerpac），转膜仪（美国Bio-Rad公司，型号Mini Trans-Blot C），超净工作台（美国Thermo Fisher，型号Heraguard EC），荧光定量PCR仪（ROCHE，FAST480Ⅱ型）。

2 实验方法

2.1 药物血清制备

实验大鼠适应性饲养3 d，随机分为空白组和给药组。给药组给予肺复方膏剂10 mL/kg灌胃，按临床等效剂量2倍，每日2次，连续3 d。空白组给予等量生理盐水灌胃。末次给药1 h后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主动脉取血，静置，3500 r/min离心10 min，取上清液，56 ℃灭活30 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置于-20 ℃冰箱保存备用。同时以生理盐水制备正常大鼠血清作对照。

2.2 细胞培养及实验分组

A549细胞用含10%FBS RPMI培养基，于5%CO2、37 ℃培养箱中培养。选择对数生长期A549细胞，实验分为空白血清组（正常血清培养基）和肺复方低、中、高剂量组（分别加入5%、10%、15%肺复方药物血清培养基），用大鼠正常血清配制成15%血清培养体系，每组加100 ng/mL SDF-1处理48 h。

2.3 Transwell检测细胞侵袭能力

Matrigel与无血清培养基按1∶2稀释后每个小室铺胶60 μL，置于37 ℃培养箱内60 min使胶凝固，制备Transwell小室，然后每个小室加70 μL基础培养基，37 ℃、30 min水化基底膜。将A549细胞用无血清基础培养基（含5 g/L BSA）制成A549细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL，吸取100 μL加至小室上室内，下室加入含10%FBS完全培养基，培养24 h。弃去小室内培养液，用湿棉签擦尽上室面Matrigel和细胞，甲醇固定30 min，用0.5%结晶紫染色5 min，倒置显微镜下观察并拍照。

2.4 Western blot检测CXCR4、PI3K、p-Akt、E-cadherin、Vimentin蛋白表达

收集A549细胞，加200 µL RIPA裂解液和1%PMSF提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量后上样SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，5%BSA封闭60 min，剪取对应蛋白条带，分别加入CXCR4（兔抗，稀释比1∶1000）、PI3K（兔抗，稀释比1∶1000）、p-Akt（兔抗，稀释比1∶1000）、E-cadherin（兔抗，稀释比1∶1000）、Vimentin（兔抗，稀释比1∶2000）和β-actin（鼠抗，稀释比1∶2500）一抗，4 ℃过夜，TBS-T冲洗3次×5 min，将稀释后的二抗（用封闭液稀释HRP标记的二抗，稀释比例1∶5000，二抗兔抗与一抗兔抗，二抗鼠抗与一抗鼠抗对应）与膜共同孵育2 h，TBS-T冲洗3次×5 min，ECL显影。将各条带用Image J软件进行灰度扫描，并以β-actin为内参计算各组平均值。

2.5 RT-PCR检测E-cadherin、Vimentin、CXCR4 mRNA表达

收集A549细胞，提取总RNA，BCA法测定浓度，按反转录试剂盒说明书进行RNA反转录cDNA，反转录条件：37 ℃、30 min，85 ℃、20 s。然后以cDNA以模板，β-actin为内参基因，SYBR Green PCR试剂盒扩增E-cadherin、Vimentin和CXCR4，扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性5 s，59 ℃退火30 s，共45个循环。每组设置3个复孔，用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。基因引物序列见表1。

3 统计学方法

表1 PCR各基因引物序列

基因名称引物序列（5’～3’）产物长度/bp E-cadherinF：CTACAACGCTGCCATCGCCTA267 R：ACTTGACCCTGATACGTGCTT VimentinF：GTCCACACGCACCTACAGTCT 159 R：AAGTCCACCGAGTCTTGAAGC CXCR4F：TCTGTGACCGCCTTTACCC269 R：ACATCCTTGCTTGATGACCC β-actinF：ACCCTGAAGTACCCCATCGAG224 R：AGCACAGCCTGGATAGCAAC

4 结果

4.1 肺复方对A549细胞侵袭能力的影响

采用铺有人工基底膜Matrigel的Transwell小室，模拟肿瘤细胞穿过血管基底膜的过程，用穿膜细胞多少反映肿瘤细胞体外侵袭能力。与空白血清组比较，肺复方低、中、高剂量组A549细胞侵袭数显著下降（＜0.01）。结果见表2。

表2 各组A549细胞侵袭能力比较（±s，个）

注：与空白血清组比较，**＜0.01

4.2 肺复方对A549细胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达的影响

与空白血清组比较，肺复方低、中、高剂量组A549细胞CXCR4、Vimentin、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达均一定程度降低，差异有统计学意义（＜0.05，＜0.01），E-cadherin蛋白表达明显上调（＜0.01）。结果见图1、表3。

注：1.空白血清组；2.肺复方低剂量组；3.肺复方中剂量组；4.肺复方高剂量组

表3 各组A549细胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达比较（±s）

注：与空白血清组比较，*＜0.05，**＜0.01

4.3 肺复方对A549细胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin mRNA表达的影响

与空白血清组比较，肺复方低、中、高剂量组A549细胞CXCR4、Vimentin mRNA表达明显降低，（＜0.05，＜0.01），肺复方高、中剂量组A549细胞E-cadherin mRNA表达明显升高（＜0.01），肺复方低剂量组A549细胞E-cadherin mRNA表达变化不明显（＞0.05）。结果见表4。

表4 各组A549细胞CXCR4、E-cadherin、Vimentin mRNA表达比较（±s）

注：与空白血清组比较，*＜0.05，**＜0.01

5 讨论

肺癌属中医学“肺积”“肺岩”“息贲”“虚劳”等范畴。中医认为“肺为贮痰之器”，《太平圣惠方》“夫痰毒者，由肺脏壅热，过饮水浆，积聚胸膈，冷热之气相搏，结实不消……皆由痰毒壅滞也”。蒋益兰教授认为肺癌发病机制为正气先虚，邪毒乘虚而入，使肺气闭郁，宣降失司，气机不畅，气滞血瘀，肺络受阻，津液输布不利，壅结为痰，瘀痰交阻，日久成积。本病以正虚为本，邪实为标，虚以气阴两虚、脾肾虚弱最为常见，实则不外气滞、血瘀、痰凝、毒聚。肺复方中白参、黄芪、灵芝、茯苓益气健脾，培土生金；麦冬、百合、白芍养阴润肺；川贝母、桔梗、法半夏化痰宣肺，升降相因；臭牡丹、半枝莲、白花蛇舌草清热解毒，软坚散结，并制白参、黄芪、法半夏温热之性；肾主骨生髓，肝肾同源，枸杞子补益肝肾；三七活血化瘀；甘草调和诸药。全方共达益气养阴、清热解毒、化痰散瘀、软坚散结、攻补兼施之功。

前期研究表明，肺复方对Lewis肺癌裸鼠移植瘤具有抑瘤作用及抗血管生成作用[11]，提示肺复方对肺癌生长转移有一定作用。有研究显示，肿瘤细胞大多通过与炎性细胞浸润相似的机制参与肿瘤的进展和侵袭转移，细胞浸润过程需趋化因子信号途径调控[12-13]。CXCR4是唯一广泛表达于多种肿瘤细胞表面的趋化因子受体，临床上CXCR4高表达明显促进肺癌恶性进展[14]，CXCR4是由352个氨基酸组成的具有跨膜结构的G蛋白偶联受体。基质细胞衍生因子SDF-1与肿瘤细胞上的CXCR4结合后能激活异源三聚体G蛋白，Gβγ直接结合PI3K调节亚基以活化PI3K，通过PIP3的二级信使作用激活下游信号分子Akt，Akt磷酸化，最终通过PI3K/Akt途径发挥促肿瘤转移作用[15]。

研究表明，上皮间质转化（EMT）是肿瘤转移的一大特征，与肿瘤侵袭和转移密切相关[16]。此过程中上皮细胞失去极性而细胞间黏附能力下降，同时获得间质细胞表型以及运动和侵袭能力，表现为细胞表面上皮标志物E-cadherin下调，间质标志物Vimentin上调。PI3K/Akt信号通路是EMT的常见通路之一，有研究证实激活的PI3K诱导其下游信号分子Akt磷酸化，促进EMT[17]。

本实验结果表明，A549细胞加入SDF-1后SDF-1/CXCR4生物轴活化，模拟肺癌微环境中基质细胞分泌SDF-1作用于肿瘤细胞，设置5%、10%、15%肺复方药物血清处理A549细胞后，肺复方各剂量组较空白血清组均能下调CXCR4和PI3K、p-Akt蛋白表达，上调E-cadherin表达，间质标志物Vimentin下调明显，同时肺复方中、高剂量组能降低CXCR4、Vimentin的mRNA表达，升高E-cadherin 的mRNA表达。基于SDF-1/CXCR4生物轴下游信号传导通路之一是PI3K-Akt信号通路，PI3K-Akt通路是影响EMT的通路之一，本研究结果表明，肺复方抑制肺癌转移与通过下调A549 CXCR4蛋白和mRNA表达，一定程度上使SDF-1/CXCR4生物轴失活，抑制PI3K/Akt信号传导通路活化，抑制EMT进程有关。肺复方通过调控SDF-1/CXCR4生物轴抑制肺癌侵袭转移是直接还是间接通过PI3K/Akt信号传导通路，抑制EMT进程是否还存在其他信号通路，需要将PI3K/Akt信号通路激活或抑制后作进一步研究。

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Effects ofon Lung Cancer A549 Cells Invasion Based on SDF-1/CXCR4 Axis

TAN Xiaoning, ZHU Kejian, JIANG Yilan, LUO Ji, LUO Yan, LYU Yuan, MA Sijing, LI Yongmin

To observe the effects ofon the invasion ability of lung cancer A549 cells; To explore the mechanism of action from the perspective of SDF-1/CXCR4 biological axis regulation.The experiment was divided into blank serum group (normal serum medium) andlow-, medium-, and high-dosage groups (adding 5%, 10% and 15%serum medium respectively). Each group was treated with matrix derived factor 1 (SDF-1) for 48 h. Transwell was used to detect the invasion ability of A549 cells. Western Blot was used to detect the expressions of SDF-1 specific receptor CXCR4, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), protein kinase B (Akt), p-Akt, E-cadherin and Vimentin in each group. The gene expression levels of E-cadherin, Vimentin and CXCR4 were detected by RT-PCR.Compared with the blank serum group, the invasion ability of A549 cells inlow-, medium- and high-dosage groups was significantly reduced (<0.01). Compared with the blank serum group, the protein expressions of CXCR4, PI3K, Akt, p-Akt and Vimentin of A549 cells in thelow-, medium- and high-dosage groups all decreased to a certain extent, and the protein expression of E-cadherin was up-regulated, with statistical significance (<0.05,<0.01); the mRNA expressions of CXCR4 and Vimentin in A549 cells were down-regulated inlow-, medium-, and high-dosage groups, while the expression of E-cadherin mRNA in A549 cells inmedium- and high-dosage groups was up-regulated, with statistical significance (<0.05,<0.01).can inhibit the invasion ability and the epithelial-mesenchymal transition process of A549 cells, and the mechanism may be related to the biological axis regulation of SDF-1/CXCR4 on PI3K/Akt pathway.

lung cancer;; SDF-1/CXCR4 biological axis; epithelial-mesenchymal transition; A549 cell

R285.5

A

1005-5304(2020)09-0058-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202003132

国家自然科学基金（81503452、81803787）；湖南省中医药研究院重点项目（201804）

李勇敏，E-mail：lym0937@126.com

（2020-03-05）

（2020-03-19；编辑：华强）