霉变培养对果蝇眼色突变的影响*

欧阳雪艳 华树海

（广东省湛江市第二中学 广东湛江 524022）

霉菌污染给人类的生产和生活带来很多危害，食物霉变会导致外观溃烂变形、产生腐败气味和黏液污秽物等，不仅降低食品的营养价值，而且还可能产生各种有毒有害物质，引起食用者急性中毒或慢性毒害。食物发霉后，二级胺、亚硝酸盐等含量会提高，为亚硝胺的合成提供了物质条件。有研究表明，大鼠食用霉变食物后，在胃内合成了亚硝胺，且在胃内停留时间越长，合成的亚硝胺就越多。同时不排除有其他致癌物（例如霉菌毒素）的形成。霉变产生的毒素可能导致动物生长受阻、繁殖机能下降、组织坏死、免疫抑制、致癌及基因突变等［1］。本文通过研究霉变培养对果蝇眼色的影响，以探索霉变对动物生长发育的毒性。

1 实验原理

1）通过每一代果蝇雌雄间交配，并重复多代以减少个体间的基因差异，得到同性别个体基因较一致的种系果蝇。

2）果蝇眼睛颜色的表现是由于大约80 多个基因在不同发育阶段的表达和相互作用，这些基因的作用包括参与眼色素前体物的运输、色素颗粒的合成、色素颗粒转运和色素颗粒的沉积［2］。

3）霉变毒素影响果蝇眼色的表现过程。

2 实验过程

2.1 实验材料和用具

实验材料：野生型黑腹果蝇。

实验器具和药品：数码显微镜、保温箱、电磁炉、高压灭菌锅、电子天平、培养瓶（锥形瓶）、量筒、白纸若干、纱布、小塑料条、药棉、酵母粉、记号笔、胶圈、棉线、玉米粉、琼脂、白糖、丙酸等。

2.2 实验方法和步骤

2.2.1 培养基配方 玉米粉10 g、琼脂粉1.5 g、酵母粉0.7 g、丙酸0.5 mL、水76 mL、白糖13.5 g。

2.2.2 培养基的配制

1）果蝇正常培养基的配制。在38 mL 水中加入琼脂粉和白糖，煮沸使其充分溶解（期间不断搅拌，防止糊底）。另取38 mL 水加入玉米粉搅匀，缓慢倒入上述琼脂溶液中，继续搅拌成糊状煮沸。待培养基冷却至70℃后加入0.5 mL 丙酸搅拌均匀，趁热将培养基装入培养瓶中约2 cm 厚，加盖纱布棉塞后冷却待用。培养瓶与纱布棉塞等应提前高压灭菌［3］。接种果蝇前，再加入酵母粉和已消毒的小塑料条。

注意事项：①培养基分装时需要注意的问题比较多，否则容易受到污染。最好在无菌室或超净工作台上分装培养基，倒培养基时应注意不要沾到瓶口及瓶壁。②分装好培养基的培养瓶及时盖上纱布棉塞，冷却放置1～2 d，待培养瓶上的水汽蒸发干。③不能过早将酵母粉加入培养基中，否则容易失活影响果蝇食用。

2）果蝇霉变培养基的配制。按上述配方配制培养基，不添加丙酸，不需要无菌操作。冷却后用单层纱布封口，在室内分别放置6 d、12 d、24 d、30 d，使培养基发生不同程度的霉变。

2.2.3 对野生型果蝇的培养至第5 代 将野生型果蝇转移至果蝇正常培养基中，斜放3 cm×10 cm的粗糙面的塑料条，在适宜温度（约25℃）下进行培养。每星期更换一次培养基，对每一代的果蝇子代与亲代进行分离，直至第5 代幼虫。

2.2.4 霉变培养基中培养第6 代果蝇 将第5代果蝇幼虫均分为2 个重复组，每个重复组随机均分为4 组，分别转移至不同发霉程度的培养基中进行培养，定期观察果蝇生活状态和生活力。待其交配并产生第6 代果蝇幼虫后，将第5 代果蝇成虫转移出培养基，并继续在各霉变培养基中培养第6 代果蝇至成虫。

2.2.5 第6 代果蝇成虫的麻醉 在麻醉瓶的棉塞上滴加少量乙醚，然后迅速拔去装有果蝇培养瓶的棉塞。使培养瓶和麻醉瓶口相对，并拍打培养瓶使果蝇全都进入麻醉瓶，然后迅速将麻醉瓶塞上棉塞。麻醉后将果蝇倒在白磁板上。当果蝇翅膀上翘45°时，表示已死亡，不可再用［4］。

2.2.6 观察果蝇第6 代的性状 使用数码显微镜，调至侧面光源，将昏迷的果蝇置于载玻片上，不加盖玻片，即可清晰观察到果蝇各结构特征。甚至能观察到昏迷果蝇的腹部运动，还可拍摄完整、清晰的图片，便于结果的记录、对比和分析。

3 实验结果

3.1 果蝇主要性状观察 观察经乙醚麻醉后果蝇的外部形态，包括口器、触角、眼色、体色、翅形和刚毛等（图1～图3）。并从体形大小、腹背部条纹数、尾部圆锐和复杂程度、性梳的有无等特征鉴别果蝇的性别。性梳是一种梳状的黑色鬃毛状结构，位于雄果蝇前足第一附节前端的指状突起处。雌果蝇无性梳，这是果蝇雌、雄鉴别的重要依据［5］。

图1 果蝇前足刚毛

图2 果蝇口器

图3 果蝇腹部条纹

3.2 霉变培养对果蝇眼色的影响

3.2.1 图片比较（图4～图6）

图4 野生型和亮红眼果蝇（圆圈标注）

图5 红眼（野生型）

图6 亮红眼（突变型）

3.2.2 数据记录（表1、表2）

表1 不同程度发霉培养基中第6 代果蝇野生型和突变体的数量统计（重复组1）

表2 不同程度发霉培养基中第6 代果蝇野生型和突变体的数量统计（重复组2）

4 实验结果分析

结果表明，霉变培养的2 个重复组中均有果蝇个体突变，且随着霉变程度的增大，果蝇眼色变异率有增大趋势。

5 实验过程中所遇到的问题及解决方案

5.1 实验温度不适宜 果蝇培养的适宜温度为23～25℃。培养温度高于30℃时，会导致果蝇不育甚至死亡。培养温度过低，果蝇生活周期会延长，生育力和生活力会下降。因此，可根据实际情况，将果蝇培养瓶置于适宜温度的保温箱中，定时观察果蝇生活力及状态。

5.2 培养基过湿或过干 实验过程中会出现培养基过湿或过干的现象。过早地将酵母粉加入培养基，容易使培养基提前发酵，导致培养基湿度过大，粘住果蝇翅膀致其死亡，影响果蝇接种。培养基因失水而干结成块，与瓶壁分离，不仅不利于果蝇产卵，且容易造成果蝇掉入缝隙致死。因此，培养过程中要视培养基情况及时转接果蝇，酵母粉的选择与添加时间也影响培养基的干湿，要谨慎挑选酵母粉并在转移果蝇前加入培养基；为防止果蝇溺水可在培养瓶中斜放已消毒的3 cm×10 cm粗糙面塑料条（改变使用纸条的做法，纸条易吸水皱缩和发霉），为果蝇提供活动场所。

5.3 果蝇子代的转移 果蝇产卵一段时间后，卵将进入幼虫阶段，幼虫身体呈乳白色，较柔软，此时需要对幼虫进行转移，以防培养基较长时间不更换而发霉，影响果蝇幼虫的生长和发育。一旦果蝇幼虫结茧便会粘附在培养瓶壁上，强行取下进行转移会造成部分果蝇茧破裂而死亡，降低了果蝇子代的成活率。综上，必须在果蝇幼虫发育成茧之前对果蝇幼虫进行培养基的转移。由于果蝇幼虫较柔软，可使用棉签刮下培养瓶壁上的果蝇幼虫，注意动作要轻缓，以免对果蝇幼虫造成伤害。

5.4 更换培养基时果蝇成虫的转移 更换培养基时果蝇成虫的转移较困难，既要防止果蝇飞出造成不同组混杂，又要避免对果蝇成虫造成伤害，降低成活率。可使用已消毒的白纸，卷成漏斗状，上部与原培养瓶口紧密相连，下部留出足够果蝇进入的小孔并与新培养瓶口相连。既可保证进入培养基的果蝇是活动力较强的果蝇，又可防止其他污染物进入培养基。培养瓶下垫海绵，转移过程中将培养瓶不停地敲打垫有海绵的桌面，使果蝇通过漏斗型的纸筒小孔掉入培养基中。

6 研究创新点

6.1 材料创新 为了研究霉变对动物生长发育的影响，本实验使用生长周期短、繁殖速度快、相对性状明显的果蝇作为实验材料。果蝇作为模式生物在初、高中实验中却较少被使用，本实验为初、高中生物学教学中围绕果蝇开展实验提供了可行途径。

6.2 方法创新

1）改变传统使用体视镜观察果蝇的方法，采用数码显微镜观察，使用侧面光源，清晰地观察到放大倍数较高的果蝇结构特征，并可拍摄观察与分析。

2）在转移果蝇成虫时，使用自制纸漏斗对其进行转移。培养瓶下垫些海绵，转移过程中将培养瓶不停地敲打垫有海绵的桌面，使果蝇通过纸漏斗的小孔掉入培养基中。

3）为防止果蝇溺亡可在培养基中斜放已消毒过的3 cm×10 cm 的粗糙面的小塑料条，为果蝇提供活动场所。

6.3 目的创新 经查证，已有的研究主要集中在酒精、甲醛等物质对果蝇生长发育和繁殖力各方面的影响，很多实验在培养果蝇过程中避免培养基霉变，但少有实验课题在霉变是否影响果蝇的生长发育方面做研究。本实验从果蝇生长环境中最常见的霉变出发，通过将基因型基本相同的果蝇放置于不同发霉程度的培养基中，观察霉变的培养基是否对果蝇眼色变异有影响，开创了新的实验思路和方向。

果蝇眼色的控制因生化机制包括许多环节而存在多基因一效现象。研究表明，亮红眼果蝇眼黄素含量极显著低于野生型果蝇，而其果蝇喋呤含量无显著差异。scarlet基因的产物负责果蝇眼黄素的跨膜运输，研究者在scarlet基因中检测到了7.5 kb的逆转座子412 元件的插入，他们认为果蝇亮红眼是scarlet基因突变导致转录提前终止，其编码蛋白部分缺失或完全丧失功能,从而引起果蝇眼睛中眼黄素合成水平的降低，使得其呈现亮红色［2］。逆转座子在果蝇的生命周期中具有活性，同时还受到一系列环境和生理因子的调节，例如，幽醇类激素、胁迫、cAMP 水平、DNA 损伤因子等。霉菌毒素具有致畸、致癌、致变态等作用，对于DNA 稳定性有较大影响［6］。霉变培养中的霉菌毒素作为果蝇生活的胁迫条件，可能影响果蝇DNA 内部逆转座子的活性，进而引起果蝇亮红眼突变的发生。