miR-149-5P调控β-catenin/MMP2/E-cadherin介导胃癌BGC-823和MKN28的细胞迁移

李 丹，高 艺，冯 芸，燕 婧，刘文奇

(1.延安大学医学院，陕西 延安 716000；2.延安市人民医院普外科二病区，陕西 延安 716000)

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，根据2018年全球癌症统计数据，胃癌在世界范围内恶性肿瘤发病率居第5位，死亡率居第3位，东亚地区胃癌发病率居世界首位[1]。胃癌的发生发展是一个多步骤、多因素的过程，受到多种因素的影响，由于缺乏典型的早期症状，大多数患者被明确诊断时已为晚期。因此寻找一种早期诊断或治疗性胃癌的生物标志物是非常必要的。虽然人们已经对胃癌发生发展的分子机制进行了大量的研究，但是识别新的胃癌检测和治疗靶点仍然是一个巨大的挑战[2]。

microRNAs(MiRNAs)是一种小的非编码RNA，能识别特定的目标mRNAs，通过与靶向mRNAs的3′-非翻译区(3′-UTR)结合，参与基因表达的转录后调控[3]。许多研究表明miRNAs在肿瘤的生物学行为中起着至关重要的作用，包括增殖、凋亡、转移和侵袭[4-6]。miR-149作为microRNAs中的一员，位于人类染色2q37.3。研究显示miR-149在非小细胞肺癌、结直肠癌、卵巢癌中表达异常，可发挥抑癌作用[7-9]。恶性肿瘤的转移是导致患者死亡、影响患者预后的重要因素。有研究指出miR-149在肿瘤的转移和侵袭中发挥重要作用，王强，等[10]人的研究表明miR-149-5P在口腔鳞状细胞癌细胞中低表达，并且通过靶向CDK6抑制口腔鳞状细胞癌细胞的迁移。本试验选取人胃癌细胞BGC-823和MKN28作为研究对象，检测miR-149-5P在胃癌细胞BGC-823和MKN28中的表达情况，并在这两个细胞系中转染miR-149-5P模拟物以及抑制剂，观察其对胃癌细胞BGC-823和MKN28迁移的影响，从而探讨miR-149-5P对胃癌生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

GES-1与BGC-823和MKN28细胞均来自西安交通大学医学部生物医学中心，实验提取总RNA所用Trizol裂解液、逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq TMⅡ均购自康润生物公司，miR-149-5P mimics、NC、inhibitor、inhibitor-NC均购自上海吉玛制药技术有限公司。转染试剂购自Poly plus生物公司，抗体β-catenin、MMP2、 E-cadherin购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 GES-1采用DMEM培养基培养，BGC-823和MKN28细胞采用RPMI-1640培养基培养，在培养基中添加10% FBS，将细胞置于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养，2～3天换液，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 qRT-PCR Trizol法提取GES-1、BGC-823和MKN28细胞的总RNA,按照逆转录试剂盒说明书的步骤合成cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒将cDNA进行PCR扩增，检测miR-149-5P在GES-1与BGC-823和MKN28细胞中的表达。研究中所使用的miR-149-5P qRT-PCR引物委托北京擎科新业生物技术有限公司进行合成。序列如下：正向引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，反向引物：5′-TGCTTCTGGCTCCGTGTCTT-3′。

1.2.3 细胞转染 转染分4组：miR-149-5P mimics组、NC组、inhibitor组和inhibitor-NC组。Mimics序列：5′-UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC-3′，5′-GAGUGAAGACACGGAGCCAGAUU-3′；NC序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；inhibitor序列：5′-GGGAGUGAAGACACGGAGCCAGA-3′；inhibitor-NC序列：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。根据转染试剂说明书进行转染。取对数生长期生长良好的BGC-823和MKN28细胞，以适当密度铺至6孔板，转染24 h后，提取RNA，采用qRT-PCR检测其转染效果。

1.2.4 细胞划痕实验 用记号笔在6孔板的底部均匀划3条直线，取对数生长期良好的细胞接种在6孔板培养24 h，待细胞融合度达到70%～80%时转染4 h后用10 μL白色枪头在培养基底部划线。PBS洗去脱落的细胞，采集0 h图像。然后加入2 mL含1%FBS的培养基放入培养箱继续培养，分别采集24 h和48 h图像。观察过表达或抑制miR-149-5P对BGC-823和MKN28细胞迁移能力的影响。

1.2.5 Transwell实验 将生长状态良好的细胞接种到24孔板中培养24 h，待细胞融合度达到70%～80%时转染，24 h后消化离心收集细胞，用不含FBS的培养基重悬细胞并计数，在Transwell小室的上室接种3×105个细胞，细胞悬液体积为200 μL，(不含FBS)。在小室的下室加入600 μL含10%FBS的培养基，置于培养箱中培养24 h后用4%多聚甲醛将小室固定15 min，1%结晶紫染液染色30 min后取出小室用蒸馏水洗涤，拿棉签擦去未穿过膜的细胞。显微镜下可以观察到穿过膜的细胞被染成紫色，采集图像。最后将拍照后的小室放入未使用过的24孔板培养孔中，加入600 μL二甲基亚砜(DMSO)振荡30 min溶解结晶紫，将溶有结晶紫的DMSO转移到96孔板中，每孔200 μL，在570 nm测吸光值。检测过表达或抑制miR-149-5P后BGC-823和MKN28细胞的迁移能力。

1.2.6 Western blot实验 取生长状态良好的细胞，以适当密度铺至6孔板，转染48 h后，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，100℃使蛋白变性5 min。配置10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳,取20 μg蛋白上样，湿转法转膜150 min，将蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭40 min。分别按1∶1000配置β-catenin、MMP2、E-cadherin，1∶5000配置β-actin的一抗工作液(TBST溶液进行稀释)，室温孵育1 h，4℃过夜，TBST洗膜三次，每次10 min。将PVDF膜浸于二抗孵育液中，正面朝上，室温摇床上孵育60 min，弃掉二抗孵育液，TBST洗膜三次，每次10 min。配置化学发光剂(A液∶B液=1∶1)显影，用凝胶成像系统采集图像。

1.2.7 统计学方法 应用SPSS25统计软件分析，应用Student′st检验比较处理组和对照组间的差异。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-149-5P在GES-1与BGC-823和MKN28细胞中的表达

qRT-PCR检测miR-149-5P在GES-1与BGC-823和MKN28细胞中的表达，结果显示，与GES-1细胞相比，miR-149-5P在BGC-823和MKN28细胞中的表达明显降低(P<0.01，见图1)。

2.2 miR-149-5P mimics和inhibitor转染效率检测

qRT-PCR结果显示转染mimics后，BGC-823和MKN28细胞中miR-149-5P表达水平显著升高(P<0.01)，而转染inhibitor后，miR-149-5P在BGC-823细胞和MKN28细胞中的表达水平下降(P<0.01，见图2)。

2.3 细胞划痕实验验证miR-149-5P对BGC-823和MKN28细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示：在BGC-823和MKN28细胞中，相较于对照组，转染mimics后细胞的迁移能力明显降低；当转染inhibitor后，相较于对照组，BGC-823和MKN28细胞的迁移能力升高，但是趋势不是非常明显，见图3、4。

2.4 Transwell实验验证miR-149-5P对BGC-823和MKN28细胞迁移能力的影响

Transwell实验结果显示：在BGC-823和MKN28细胞中，相较于对照组，转染mimics后穿过小室的细胞数明显减少，细胞的迁移能力明显降低(P<0.01)；当转染inhibitor后，相较于对照组，穿过小室的BGC-823细胞数明显增多(P<0.01)，细胞的迁移能力升高。而与对照组相比，穿过小室的MKN28细胞数没有明显变化(见图5、图6)。

2.5 Western Blot实验检测干扰miR-149-5P后BGC823和MKN28细胞中β-catenin、MMP2和E-cadherin的蛋白表达

Western Blot实验结果显示：与对照组相比，转染mimics后，BGC-823和MKN28细胞中β-catenin和MMP2蛋白表达明显降低，E-cadherin蛋白表达明显升高；而转染inhibitor后，相比于对照组，BGC-823细胞中β-catenin和MMP2蛋白表达升高，E-cadherin蛋白表达降低，但MKN28细胞中β-catenin、MMP2和E-cadherin的蛋白表达没有明显变化，见图7。

3 讨论

胃癌是由胃粘膜上皮细胞衍生而来的恶性肿瘤之一，随着医学的进步，胃癌的发病率呈下降趋势，但仍居我国恶性肿瘤前列[11]。由于在胃癌早期缺乏高灵敏度及特异度的指标，部分患者确诊时已有远处转移，而转移是临床治疗胃癌的最大挑战之一，也是患者生存率下降的主要原因。因此,如何有效预防与治疗胃癌细胞的转移成为延长患者生存期、改善预后的重要基础。随着肿瘤生物学的深入研究及分子技术水平的不断提高，大量研究表明miRNA的异常表达与胃癌的发生发展密切相关。有文献报道miRNA-452在胃癌组织和细胞中表达上调，促进胃癌细胞的增殖和迁移，发挥癌基因的作用[12]。miR-139在胃癌组织和细胞中低表达，抑制胃癌细胞生长，降低MMP11在胃癌微环境中的转移，发挥抑癌基因的作用[13]。Xu，等[14]研究发现miR-149在结直肠癌组织和细胞中低表达，过表达miR-149可以抑制细胞迁移和侵袭，且miR-149可以靶向转录因子FOXM1抑制结直肠癌细胞的迁移侵袭。Jin，等[15]发现miR-149在肾癌组织和细胞中低表达。与对照组相比，转染miR-149模拟物后肾癌786-O和ACHN细胞迁移能力明显减弱，说明miR-149可以抑制肾癌细胞迁移。在乳腺癌中，Dong，等[16]人的实验结果证明miR-149靶向GIT1抑制乳腺癌细胞的迁移。然而也有研究发现miR-149在一些肿瘤中高表达，发挥癌基因作用。Shen，等[17]发现miR-149在神经胶质瘤细胞中高表达，通过靶向caspase-2促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。Bellazzo，等[18]发现过表达miR-149-3P后可以抑制DAB2IP基因，通过激活NF-KB信号通路，促进前列腺癌细胞的增殖和迁移能力。以上研究说明miR-149参与调控恶性肿瘤细胞的迁移过程。

在本研究中，我们选择胃癌BGC-823和MKN28细胞进行实验，从而研究miR-149-5P对胃癌细胞BGC-823和MKN28迁移能力的影响。首先我们采用qRT-PCR方法检测miR-149-5P在GES-1与BGC-823和MKN28细胞中的表达，研究结果显示相比于对照组，miR-149-5P在BGC-823和MKN28细胞中的表达明显降低。随后我们转染miR-149-5P mimics和inhibitor，qRT-PCR结果显示转染miR-149-5P mimics能够显著促进miR-149-5P的表达，而miR-149-5P inhibitor的转染可以抑制其表达。细胞划痕实验和Transwell实验结果也表明过表达miR-149-5P后胃癌细胞BGC-823和MKN28迁移能力减弱，提示miR-149-5P可以抑制胃癌BGC-823和MKN28细胞迁移。而抑制miR-149-5P后BGC-823细胞的迁移能力增强，但MKN28细胞的迁移并没有明显变化，这可能是因为miR-149-5P在MKN28细胞中表达较低的原因。β-catenin是细胞内的一种多功能蛋白，通过与细胞骨架的相互作用，协助细胞对胞外信号作出反应，它作为Wnt信号通路中的核心调控蛋白主要参与细胞黏附过程[19]。Wnt/β-catenin信号通路可以诱导上皮细胞发生上皮-间质转化，细胞核中的β-catenin表达升高可以增强肿瘤细胞的迁移能力，也有研究表明Wnt/β-catenin信号通路可促进胃癌细胞增殖及迁移[20]。基质金属蛋白酶2(MMP2)可以降解细胞外基质，其高表达促进肿瘤的侵袭和转移。E-cadherin在正常上皮组织中具有维持细胞间紧密连接、限制细胞运动和转移的作用，其高表达可以抑制肿瘤的侵袭转移。我们用Western Blot实验检测转染miR-149-5P mimics或inhibitor后BGC-823和MKN28细胞中β-catenin、MMP2和E-cadherin蛋白表达水平。结果显示，相比于对照组，转染mimics后,BGC-823和MKN28细胞中β-catenin和MMP2蛋白表达降低，E-cadherin的蛋白表达升高；转染inhibitor后BGC-823中β-catenin和MMP2蛋白表达升高，E-cadherin的蛋白表达下调，而MKN28细胞中E-cadherin、β-catenin和MMP2蛋白表达水平并无明显变化，这也许和miR-149-5P在MKN28细胞中表达较低有关。综述所述，实验结果表明miR-149-5P抑制胃癌细胞BGC-823和MKN28的迁移，为后续深入研究miR-149-5P的靶基因及其在胃癌发生发展中的作用奠定基础。