大黄素对建鲤生长性能、抗氧化指标及肝脏CYP450酶的影响

曹丽萍， 杜金梁， 贾睿，丁炜东，Jeney Galina，徐跑，殷国俊*

(1.农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081； 2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 农业农村部鱼类免疫药理学国际联合实验室，江苏 无锡 214081； 3.Research Institute for Fisheries,Aquaculture and Irrigation,Ann light 8,Szarvas H-4440,Hungary)

近年来，水产养殖业迅速发展，然而高养殖密度，高蛋白、高脂肪饲料的频繁使用，抗病药物的滥用等使得养殖环境日益恶化，鱼类病害较为严重[1]。肝脏作为鱼体最大的代谢器官，在鱼类消化、排泄、解毒及免疫等多种生命活动中发挥重要作用，但其易受到各种毒物、病原累及[2-3]，导致肝组织受损，进而引起代谢紊乱诱发细菌和病毒感染，甚至导致鱼类死亡，给养殖业造成重大损失。大量研究发现，许多中草药及其提取物都具有显著的保肝作用[4]，其作用机理显示主要与中药的清除氧自由基、抗氧化、抑制细胞色素P450酶系CYP450[5-6]及抑制NF-κB活性有关[7]。CYP450酶分布于多种组织和器官中，其中肝脏中含量最为丰富，可参与体内外多种化合物代谢，在肝损伤发生过程中起到了十分重要的作用。研究证明，在经典的CCl4诱导肝损伤模型中，CCl4通过CYP450作用代谢为三氯甲烷自由基(CCl3·)进而引起膜脂质过氧化，这是造成肝损伤的一个重要原因[8]。

大黄素(emodin, EMD),作为虎杖、大黄等传统中药的有效单体成分，在临床和生产上被广泛应用。大黄素具有显著的抗炎、抗肿瘤、抗肝纤维化作用[9]。大黄素的肝保护作用主要与抑制肝脏炎症、抑制肝星形细胞的增殖活化及调节促纤维化因子表达等方面有关[10]。目前，大黄素对鱼类肝损伤的保护作用及机理研究尚未见报道，为了阐明大黄素在鱼类上的保肝作用，本研究中以CCl4诱导建鲤CyprinuscarpioJian肝损伤，并建立在体肝损伤模型，探讨大黄素的肝保护作用及对肝细胞色素酶的影响，以期为保肝药物开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用建鲤由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心渔场提供，健康无伤，规格齐整，饲养于循环水系统中(每个缸体积为240 L)，饲养条件温度为(27±2)℃，pH为6.8～7.6，DO>5 mg/L，总氨氮<0.05 mg/L，H2S<0.01 mg/L。每天投喂量为鱼体质量的2%，驯养1周。

药品与试剂:CCl4(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司，配制成30%的CCl4-橄榄油溶液(CCl4∶橄榄油=3∶7)；大黄素标准品购自美国SIGMA公司(St.Louis，Missourk， USA)；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)购于上海严谨科技有限公司；考马斯亮蓝试剂、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(Alb)、总蛋白(TP)、超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、还原型谷胱甘肽(GSH)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 试验饲料的制备 基础饲料包括面粉17.4%、鱼粉6.0%、菜籽粕27.0%、米糠粕10.0%、棉籽粕10.0%、豆粕24.0%、磷脂1.0%、豆油1.0%、磷酸二氢钙1.5%、氯化胆碱0.1%、维生素预混料1.0%、矿物质预混料1.0%。在基础饲料中分别添加0.1%、0.3%、0.5%的大黄素，同时减少等量面粉，配制成3种试验饲料，试验饲料营养水平见表1。

表1 饲料组成及营养水平Tab.1 Ingredients and nutrient levels of experimental diets w/%

1.2.2 试验设计及饲养管理 将初始体质量为150 g左右的健康建鲤随机分为5组，每组20尾，分别为空白对照组、模型对照组(CCl4)、低剂量药物组(1 g/kg EMD)、中剂量药物组(3 g/kg EMD)和高剂量药物组(5 g/kg EMD)，每组设2个平行，每个平行10尾，放在10个缸中饲养。其中，空白和模型组均投喂基础饲料，低、中、高剂量药物组分别投喂含1、3、5 g/kg大黄素的试验饲料。每天投喂2次，记录投喂饵料量,每次投喂量为鱼体质量的2%，共养殖60 d。养殖试验结束后，给空白组鱼腹腔注射等量橄榄油, CCl4组和中药组腹腔注射30%的CCl4, 注射剂量为0.05 mL/10 g鱼体，禁食72 h，以诱导肝损伤。整个养殖及试验过程中建鲤死亡率为0。

用MS-222麻醉鱼后，对各组鱼称重、采集血液与肝组织，每组20个样品均进行测定。

1.2.3 大黄素抗氧化活性分析 采用DPPH法测定药物的抗氧化能力[11]。将DPPH用无水乙醇充分溶解后，配制成浓度为2×10-4mol/L的溶液。将大黄素配制成0、1、2、3、4、5、6 μg/mL水溶液。取2 mL DPPH乙醇溶液,加入2 mL不同浓度的大黄素溶液，混匀后避光静置30 min，在517 nm下测定每个大黄素溶液的吸光值。DPPH的抑制率与清除自由基的能力成正比，其计算公式为

抑制率=(A1-A2)/A×100%。

(1)

其中：A为2 mL DPHH溶液与2 mL无水乙醇混合后在517 nm处的吸光度；A1为2 mL DPHH溶液与2 mL大黄素溶液混合后在517 nm处的吸光度；A2为2 mL 大黄素溶液与2 mL无水乙醇混合后在517 nm处的吸光度。

1.2.4 生长指标的测定与计算 饲养试验结束后，计算出每组鱼的相对增重率(RWR,%)、特定生长率(SGR,%/d)、饵料系数(FCR)和肝指数(LI,%)，计算公式为

RWR=(Wt-W0)/W0×100%，

(2)

SGR=(lnWt-lnW0)/t×100%，

(3)

FCR=F/(Wt-W0)，

(4)

LI=WL/Wt×100%。

(5)

其中：Wt、W0分别为试验终末和初始鱼的体质量(g)；t为饲喂时间(d)；F为投喂饲料量(g)；WL为肝脏质量(g)。

1.2.5 血清和肝组织生化指标的测定 用CCl4注射建鲤72 h后，采用一次性注射器,从试验鱼尾静脉采血，血样于4 ℃下静置2 h后以3000 r/min离心15 min，分离血清，于-20 ℃下保存备用。按照试剂盒操作说明分别测定血清中相关生化指标。

对采血后的鱼进行解剖，在肝脏右中叶相同部位取肝脏组织，用预冷的生理盐水漂洗血液，剪去肝脏表面附着的结缔组织，再用滤纸吸去表面水分后称重并剪碎，移入匀浆管中，加入9 倍体积的生理盐水 (体积分数为0.86%) 进行匀浆。该匀浆以2000 r/min 离心15 min，收集上清备用。按照试剂盒操作说明分别测定肝匀浆中各项生化指标。

1.2.6 肝微粒体中CYP450酶含量的测定 采用差速离心法获取建鲤肝微粒体[12]。建鲤采净血液后迅速取出肝脏，用滤纸吸净表面水分后称重并剪碎，用KCl-磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.4)漂洗3次，洗净血水。每克肝脏加入3 mL 的KCl-磷酸缓冲液，在冰上制备匀浆。肝匀浆于4 ℃下以10 000 r/min离心20 min，弃沉淀。上清液再于4 ℃下以25 000 r/min离心30 min，弃上清，沉淀部分即为肝微粒体。向肝微粒体中加入含30%甘油的KCl-Tris-HCl 缓冲液(0.1 mol/L,pH 7.4)，吹打悬浮后分装于超低温冰箱(-80 ℃)中保存。肝微粒蛋白浓度采用考马斯亮蓝法测定[13]。

取0.5 mL肝微粒体悬液(0.5 g/L)与适量连二亚硫酸钠混合，平均分成两份，加入比色杯中并用一氧化碳充气约30 s。在450 nm和490 nm处测定样品吸光度，计算CYP450含量[14]：

CYP450含量(nmol/mg)=(A450 nm-A490 nm)×1000 /[91×蛋白浓度(g/L)]。

(6)

1.2.7 肝组织中CYP1A、CYP3AmRNA的表达检测 将建鲤处死后，迅速获取适量肝组织置于液氮中储存。按照RNAiso Reagent试剂盒操作抽提总RNA。用紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度, 当A260 nm/A280 nm值达到1.8～2.0 时可以进行反转录，以Oligo (dT)18为引物进行RT反应合成cDNA。实时荧光定量PCR反应按照TaKaRa 公司生产的ExScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time: SYBR Green I) 进行。基因特异引物及内参β-actin引物分别按照建鲤CYP1A、CYP3A和β-actin基因序列采用Primer 5.0软件设计。用2ΔΔCT法对目的基因表达进行相对定量分析[15]。引物如下：

CYP1A-F： 5′TGACAAGGACAACATCCGAGAC 3′，

CYP1A-R： 5′ATAGACGACAGCCCAAGACAGAG 3′；

CYP3A-F： 5′CACCGCTTTATTTCCTTTCATC 3′，

CYP3A-R： 5′CTCGCTTCTTCTTGTGGCCT 3′；

β-actin-F： 5′GTCAAGTCCGTTGAGATGCACC 3′，

β-actin-R： 5′GGATGATGACCTGAGCATTGAAGC 3′。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 15软件进行单因素方差分析(One way-ANOVA)，用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 大黄素清除自由基的能力

从图1可见：大黄素浓度较低时，清除DPHH能力近似线性关系，大黄素浓度为3 μg/mL时，其清除能力达到65%；随着大黄素浓度的增加，大黄素清除DPPH自由基的能力渐趋平缓，大黄素浓度为6 μg/mL时，其清除自由基能力达到81%。

2.2 建鲤生长指标的变化

试验组饲喂不同浓度的大黄素饲料60 d，在注射CCl4造模前，对建鲤生长指标进行了测定。从表2可见：与空白对照组相比，饲喂含3、5 g/kg大黄素饲料能显著提高建鲤的终体质量、相对增重率和特定生长率(P<0.05)，显著降低饵料系数(P<0.05)，且这种影响随着大黄素含量的升高，效果愈加明显；模型组与空白组均饲喂基础饲料，两组建鲤生长指标无显著性差异(P>0.05)。

表2 大黄素对建鲤生长指标的影响Tab.2 Effects of EMD on growth index of common carp

2.3 建鲤血清中生化指标的变化

从表3可见: CCl4作用建鲤72 h 后，与空白对照组相比，模型组血清中的GOT、GPT 和LDH 活性均显著升高(P<0.05)，Alb和TP含量显著下降(P<0.05); 而3、5 g/kg大黄素能显著抑制CCl4诱导GOT水平升高，5 g/kg大黄素能显著抑制CCl4诱导GPT 和LDH水平的升高(P<0.05)，同时也能显著恢复血清中Alb和TP含量(除1 g/kg大黄素组外)(P<0.05)，且随着用药剂量的提高，其作用愈加明显。

表3 大黄素对建鲤血清生化指标的影响Tab.3 Effects of EMD on biochemical indices in serum of common carp

2.4 肝组织中抗氧化指标、肝微粒体中CYP450酶及肝指数的变化

从表4可见：CCl4作用建鲤72 h后，与空白对照组相比，模型组肝组织中T-AOC和SOD活性均显著下降(P<0.05)，GSH-Px和GSH消耗明显，MDA大量生成(P<0.05);3、5 g/kg大黄素能显著防止肝组织中T-AOC、SOD、GSH-Px及GSH水平下降并显著抑制MDA生成(P<0.05)，且随着大黄素剂量升高，其作用愈加显著。

从表4还可见：CCl4作用建鲤72 h后，与空白对照组相比，模型组肝微粒体中CYP450酶含量显著增加(P<0.05)，表明CCl4对CYP450酶有诱导作用，而3、5 g/kg大黄素饲料组建鲤肝微粒体中CYP450酶含量显著降低(P<0.05)，这表明大黄素能抑制CCl4对CYP450酶的诱导，且中、高剂量大黄素抑制效果优于低剂量，即大黄素对CYP450酶的抑制作用有剂量依赖性；同时，CCl4诱导建鲤肝损伤后，引起肝组织肿大，CCl4组建鲤肝指数较空白对照组显著增大(P<0.05)，而3、5 g/kg大黄素能显著抑制CCl4导致的建鲤肝组织肿大，肝指数明显降低，且随着大黄素剂量的升高，恢复效果愈加显著(P<0.05)。

表4 大黄素对建鲤肝组织中抗氧化指标和肝微粒体中CYP450酶含量及肝指数的影响Tab.4 Effects of EMD on antioxidant ability in the liver, and CYP450 enzyme content in liver microsomes and hepato-somatic index of common carp

2.5 肝组织中CYP3A、CYP1A基因表达量的变化

从图2可见：CCl4腹腔注射建鲤72 h后，模型组肝组织中CYP3A和CYP1A的mRNA表达量较空白对照组显著升高(P<0.05)；与模型组相比，大黄素能显著抑制CCl4诱导的CYP3A(除1 g/kg大黄素组外)和CYP1A表达量的上调(P<0.05)，且随着大黄素剂量的升高，抑制作用愈加显著。

3 讨论

3.1 大黄素对建鲤生长的影响

随着水产养殖业的发展，绿色养殖、健康养殖在生产过程中越来越重要。中草药作为天然药物，具有资源丰富、污染少及毒副作用小的优点，其作为饲料添加剂被广泛应用于动物的养殖[16]。杨维维等[17]在探讨大黄素对克氏螯虾生长的影响时发现，饲料中添加50～75 mg/kg的大黄素，可显著提高克氏螯虾的成活率，降低饵料系数。明建华等[18]发现，饲料中添加大黄素可显著提高团头鲂的增重率和特定生长率，降低死亡率及饵料系数。本研究中也得到了一致的结果，饲料中添加大黄素后，建鲤的终体质量、相对增重率和特定生长率得到了显著提高，而饵料系数显著下降，这表明饲料中添加大黄素可帮助建鲤消化吸收、促进其进食，从而加速鱼体的生长，提高饵料的利用效率。

3.2 大黄素对建鲤肝功能指标的影响

作为经典的诱导动物肝损伤模型的毒物CCl4，其肝损伤机制主要与自身和其自由基代谢产物有关。CCl4经肝微粒体CYP450酶活化分解产生三氯甲烷自由基( CCl3·),引起肝细胞膜和细胞器膜脂质过氧化，从而改变了膜的流动性和通透性，最终导致肝细胞受损，此过程目前被认为是主要的肝损伤机制[19]。本研究中将30%的CCl4-橄榄油溶液腹腔注射建鲤72 h后，血清中GOT、GPT和LDH活性上升,证明CCl4改变了肝细胞膜的通透性，导致了胞浆内可溶性酶的溶出；同时肝细胞受损后，其合成白蛋白的能力降低，导致白蛋白和总蛋白含量下降。而5 g/kg的大黄素可显著抑制CCl4诱导的酶含量上升，表明大黄素可以抵抗磷脂氧化，稳定细胞膜。展玉涛等[20]利用CCl4制备大鼠肝纤维化模型研究了大黄素对肝功能的影响，结果也发现，大黄素能明显抑制CCl4诱导的血清GOT水平的提高，恢复白蛋白和总蛋白含量。

大量研究表明，大黄素具有理想的抗氧化作用。Yen等[21]研究蒽醌和蒽酮的抗氧化活性时发现，大黄素和芦荟大黄素具有较强的还原活性和清除羟基自由基的作用，在0.25 mg/mL浓度下的清除率分别达到26.2%和41.8%，表明其抗氧化机制可能依赖于清除羟自由基。罗霄山[22]发现，原代培养大鼠肝细胞在芦荟大黄素预培后，CCl4导致的肝组织中GSH损耗及MDA生成得到了明显的抑制。杨维维等[17]的研究也表明，饲料中添加大黄素能显著提高克氏螯虾的肝脏抗氧化能力，肝组织中GSH、SOD含量均显著上升。本研究中利用DPHH法测定大黄素清除自由基能力，发现大黄素为6 μg/mL时，清除自由基能力达到了81%；建鲤饲喂大黄素2个月后，能显著抵抗CCl4导致的肝大，肝指数显著降低，生长性能得到显著提高，能明显抑制CCl4导致的肝组织匀浆中的SOD、GSH-Px及GSH含量的损耗，且显著抑制脂质过氧化代谢产物MDA的大量生成，T-AOC水平得到显著提高，这些结果与其他学者的研究结论一致。大黄素对CCl4诱导的建鲤肝损伤的保护作用应与其抗氧化能力有关。

3.3 大黄素对建鲤肝微粒体中CYP450酶的影响

CYP450酶系作为机体的生物转化系统，可以广泛的代谢体内外源性物质[23]。CCl4在体内进行代谢活化的过程中，CYP450酶系发挥了关键作用，Shibata等[24]研究表明，肝组织中CYP2E1基因与CCl4诱导的肝损伤关系密切，Zhou等[25]研究认为，CYP1A1、CYP1A2及CYP3A4等代谢在CCl4的生物转化过程中同样具有重要作用。鱼类CYP1A基因在1988年被克隆后，发现其能被外源性化合物诱导且表现出剂量依赖效应[26]，苯并芘、多环芳烃、二噁英等农药都是CYP1A的诱导剂[27]，这种诱导作用使得CYP1A成为检测水体污染的指标之一。CYP3A在肝脏和小肠中含量丰富，分别约占CYP总量的30%和70%，是参与临床常用药物氧化代谢的主要酶系，是CYP家族中最重要的亚族成员[28]。研究CYP1A和CYP3A在CCl4代谢过程中的变化对剖析CCl4的损伤机理、防护及药物的选择都有指导意义[29]。 郑天慧等[30]在比较3种化学品导致的急性肝损伤大鼠模型中CYP450酶的变化时发现，CCl4能抑制大鼠CYP1A2和CYP3A4活性。而刘移民等[31]研究发现，CCl4对人体淋巴细胞瘤细胞株中CYP2E1和CYP3A4基因有明显的诱导作用，且表现出剂量效应关系。沈俊辉等[32]研究发现，CCl4对大鼠肝组织中CYP3A表达显著上调。由此可见，目前CYP450酶各亚族在CCl4诱导的肝损伤过程中含量变化表现并不统一，但与CCl4作用时间和剂量有关联[33]。本研究中CCl4作用建鲤72 h后，模型组肝微粒体中CYP450酶含量显著增加，肝组织中CYP1A、CYP3AmRNA表达量也显著上调。这表明CCl4可以通过诱导CYP450酶活性及CYP1A和CYP3A的表达，进一步促进CCl4人代谢，使得毒性产物累积，导致建鲤肝组织的损伤。本研究中采用大黄素饲喂建鲤60 d后，大黄素能显著降低肝组织CYP450酶含量，且表现出剂量效应。这表明大黄素对肝组织的保护作用与抑制CCl4对CYP450酶的诱导有关。

综上所述，大黄素对CCl4诱导的建鲤肝损伤具有保护作用且存在剂量效应。可能与其强大的抗氧化能力及抑制CCl4对CYP450酶的诱导有关。