siRNA下调AEG-1对大肠癌细胞体内成瘤影响的研究

黄素军 宋华锋 杨绮红 黎铭恩 罗国彪

【关键词】星形胶质细胞升高基因-1;小干扰核糖核酸;结直肠癌;体内成瘤

结直肠癌是威胁全球人类健康的最常见的恶性肿瘤之一。据统计，2017年全球结直肠癌新发病例约为183万例，中国大陆地区新发病例约为43万例，我国发病数在28年间增长了203.5%，已跃居我国恶性肿瘤的第4位[1]。

星形胶质细胞升高基因-1（AEG-1）是2005年Kang等[2]采用快速消减杂交的方法首次克隆出来的癌基因，位于人染色体8q22，该区域是多种恶性肿瘤高度相关地带。AEG-1在人体多种恶性肿瘤中的表达升高，在肿瘤发生中发挥着关键的致癌作用。AEG-1在结直肠癌中的蛋白表达水平明显升高，而且在正常黏膜、低级别腺瘤、高级别腺瘤和大肠癌中的表达依次升高[3-4]。

我们既往的研究显示AEG-1在结直肠癌细胞株HCT116中高表达，且在体外研究发现下调AEG-1表达会抑制结肠癌细胞增殖、克隆形成和侵袭能力，促进凋亡，增加对5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性，但体内实验是否会有肯定的结果尚待进一步研究[5-6]。为此，我们通过慢病毒介导的小干扰RNA（siRNA）技术干扰AEG-1表达构建结直肠癌稳定细胞株后进行裸鼠成瘤实验。

材料与方法

一、材料及主要试剂

采用AEG-1siRNA病毒载体，含绿色荧光蛋白（GFP）基因（psPAX，pMD2.G慢病毒包装系统，Invitrogen公司）;結肠癌HCT116细胞株（购自中国模式培养物集库存，中国北京）;免疫缺陷小鼠（购自中山大学实验动物中心）。Trizol试剂（Invitrogen公司）;RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit（#K1621，#1622，Fermentas公司）、SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（DRR820）购自TaKaRa公司;RIPA细胞裂解液和蛋白酶抑制剂（PMSF，广州博彩生物公司）;NovexECL发光试剂盒（WP20005，Invitrogen公司）;兔抗人AEG-1抗体;兔抗人GAPDH抗体（Invitrogen公司）。

二、方法

1. 慢病毒介导干扰AEG-1-siRNA稳定细胞株构建

采用化学合成方法合成以AEG-1为靶点的RNA干扰序列（AEG-1-RNAi1，s：GCAGCAAGGCAGTCTTTAAGT，as：ACTTAAAGACTGCCTTGCTGC），挑选了带GFP报告基因的慢病毒载体（RNAil组）和空载体（空载组），采用psPAX，pMD2.G慢病毒包装系统，转染成功后收取上清（病毒液），病毒感染结肠癌细胞株HCT116（HCT116对照组），转染48h后，采用0.5μg/ml嘌呤霉素的10%胎牛血清DMEM培养基筛选出阳性细胞。

2. 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测AEG-1mRNA的表达

采用Trizol试剂提取细胞的总RNA，以OligodT为引物逆转录成cDNA，逆转录条件为：65℃5min，42℃60min，70℃5min。在ABIPRISM7500qRT-PCR仪上按照两步法进行扩增，使用β-actin作为内参，计算△CT值（△CT=CT目的-CT内参）和2﹣△CT。

3. 蛋白质印迹法检测AEG-1蛋白表达

采用RIPA裂解细胞，收集上清，定量，取50μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，采用PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉室温下封闭1h后，分别加入兔抗人AEG-1抗体（Invitrogen）1∶1000和兔抗人GAPDH抗体1∶1000，4℃过夜，TBST洗涤，加入相对应的二抗，室温孵育1h，TBST洗涤，ECL显色试剂盒显影，以GAPDH为内参。

4. 裸鼠体内成瘤试验

将14只裸鼠随机分成2组即HCT116-control组和HCT116-RNAi1组，分别采用转染前后细胞株接种，将浓度为1×106个/ml的细胞悬液注射到裸鼠背部，每只0.2ml，同样条件下饲养，每周测量接种部位瘤体的最长直径a（mm）和最短直径b（mm），瘤体体积=a×b2/2（mm3）。4周后处死小鼠取出瘤体测量质量。

三、统计学处理

采用SPSS13.0进行统计分析。正态分布数据以表示，2组间比较采用t检验或者t'检验，重复测量资料采用重复测量资料方差分析，交互效应有意义时采用t检验分析单独效应，α=0.05，两两比较采用Bonferroni法校正检验水准。

结果

一、成功构建AEG-1-RNAi结直肠癌稳定细胞株

成功构建携带siRNA和GFP基因慢病毒载体，用其转染结肠癌细胞株HCT116，48h后于倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光（如图1），结果可见HCT116细胞被携带siRNA和GFP的慢病毒高效率转染，转染率大于95%。

二、qRT-PCR和蛋白免疫印迹法检测AEG-1的干扰效果

采用RNAi1干扰后AEG-1的mRNA（t=12.382，P=0.006）和蛋白（P<0.001）表达水平明显降低，siRNA能显著下调AEG-1的表达，表明成功建立低表达AEG-1的结肠癌细胞模型HCT116，见图2。

三、AEG-1对体内结肠癌细胞肿瘤发生的影响

第1周HCT116对照组处理的裸鼠已有明显的肿瘤形成（20.41±2.63）mm3，而注射AEG-1-RNAi处理的小鼠第1周肿瘤没有生长，随后2、3、4周瘤体体积分别为（10.43±3.30）、（22.31±4.55）、（47.54±10.13）mm3，对照组为（35.14±7.29）、（66.39±18.86）、（94.53±27.31）mm3（图3A），重复测量资料方差分析显示2组瘤体体积随时间变化的趋势不同，差异有统计学意义（F=3.714，P=0.025），因此分析单独效应。2组第2（t=-6.906，P=0.001）、3（t=-5.080，P=0.001）、4（t=-3.608，P=0.007）周瘤体体积比较差异均有统计学意义。4周后处死裸鼠，取出瘤体测量质量，处理组为（0.013±0.002）g，低于对照组的（0.039±0.016）g（t=-3.535，P=0.023，图3B）。

讨论

AEG-1是一个多功能的癌基因，它可以调节致癌转化，提高恶性肿瘤的侵袭性，促进肿瘤增殖、扩散、转移，诱导新生血管形成以及介导化学治疗药物耐药等[7]。在卵巢癌中，敲除AEG-1可以抑制癌细胞的迁移和侵袭[8]。AEG-1还与肿瘤的临床分期、组织分化、淋巴结转移和预后不良密切相关。AEG-1的高表达与总体生存率低相关，高表达的总生存时间明显短于低表达，其可能是肿瘤的早期预警和患者生存的独立预后指标[3，9-10]。在不同级别星形细胞瘤中，AEG-1阳性率随肿瘤恶性程度的增加而增高，表达强度与肿瘤的级别呈正相关，与生存率呈负相关[11]。

大肠癌的演变是一个涉及多基因变化的复杂的过程，由正常肠上皮转化为肠上皮化生、腺瘤、腺瘤伴不典型增生、上皮内瘤变、癌，整个过程可能与多个癌基因、抑癌基因以及多条肿瘤信号通路的变化有关。近年来发现AEG-1不仅是各器官和组织致癌过程中的关键因素，而且是复杂的肿瘤信号通路网中的关键交汇点，其可以作用于多条信号通路，包括激活核因子-κB、Ha-Ras和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（Akt）通路、ERK/MAPK和Wnt/β-catenin通路，还有Aurora-Akinas信号通路等[12-13]。在非小细胞肺癌中，AEG-1通过提高抗凋亡蛋白Bcl-2水平和激活PI3K/Akt途径抑制细胞凋亡[9]。在结直肠癌中，AEG-1通过影响β-catenin增强结直肠癌细胞的转移和侵袭能力[13]。

我们前期研究以AEG-1基因为靶点，采用siRNA可以有效抑制AEG-1的表达，通过MTT、平板克隆、transwell和流式细胞仪等方法发现在体外下调AEG-1表达会抑制结肠癌细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力，导致细胞周期G0/G1期停滞，促进凋亡和增加5-FU细胞毒性，以及影响血管生成相关因子缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的产生[5-6，14]。然而，干扰AEG-1的表达在体内试验会有怎样的结果及其相关的信号通路，我们仍然不清楚。因此我们深入研究，进一步进行裸鼠体内成瘤实验。实验结果显示，沉默AEG-1可抑制结肠癌细胞在裸鼠体内成瘤的能力，抑制肿瘤的生长，可见AEG-1在结直肠癌的癌变过程中起着重要的作用，有望成为肿瘤基因治疗的新靶点和预后评估指标。

恶性肿瘤具有无限生长潜力，与它可以诱导血管生成是密切相关的，而AEG-1可以诱导新生血管生成及促进血管生成相关因子的产生。有学者报道AEG-1肝细胞的条件培养基可以诱导显著的血管生成;在宫颈癌中沉默AEG-1可以显著下调血管生成相关因子HIF-1α、Tie2、血管内皮生长因子（VEGF）和TEM1/CD248的表达，而且人臍静脉内皮细胞在SiHa细胞或转染AEG-1的正常宫颈上皮细胞的条件培养基下培养，其血管生成能力增强[15-16]。另也有报道AEG-1与微小RNA（miRNA）关系密切，AEG-1通过介导miRNA-154表达抑制胃癌细胞的增殖，miRNA-564直接作用于AEG-1抑制甲状腺乳头状癌的侵袭性，miRNA-504通过作用于AEG-1抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖和侵袭能力[17-19]。我们前期研究发现通过上调或下调AEG-1表达会改变miRNA的表达谱，推测AEG-1可能是通过改变某些miRNA的表达，从而影响血管生成相关因子的产生[5，14]。前期研究显示上调AEG-1的表达会抑制miRNA-34a和促进HIF-1α的表达[14]。miRNA-34a是一个抑癌基因，高表达的miRNA-34a可抑制沉默信息调节因子1、损害内皮组细胞以及阻断VEGF的产物，从而抑制血管新生;而HIF-1α能使细胞更容易适应低氧的环境，是细胞对缺氧反应的最重要调节者，可以促进癌细胞表达VEGF，促进血管生成。有研究发现敲除miRNA-34a可通过激活Notch/HIF-1α信号通路，从而显著提高肝切除后10d大鼠肝功能和肝细胞再生能力[20]。也有报道指出miRNA-34a通过负性调节SIRT1/HIF-1α信号来影响2型糖尿病相关耳蜗毛细胞的凋亡[21]。这与我们在结直肠癌中发现下调AEG-1的表达会促进miRNA-34a及抑制HIF-1α表达是一致的。因此我们推测在结直肠癌中，AEG-1可能通过抑制miRNA-34a促进HIF-1α的表达，从而促进VEGF的表达，发挥促进肿瘤血管新生的作用。

综上所述，沉默AEG-1可以抑制结直肠癌细胞的体内成瘤能力，其机制可能与通过调节miRNA从而影响血管生成相关因子的产生有关，这将为进一步研究结直肠癌中AEG-1基因治疗奠定基础。