实验动物中新型冠状病毒的感染情况调查

李晓波,王 吉,付 瑞,王莎莎,王淑菁,李 威,秦 骁,黄宗文,贺争鸣,岳秉飞∗,林更涛

(1.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,北京 102629; 2.东营市疾病预防控制中心,山东 东营 257091)

由新型冠状病毒引起的肺炎,截至2020 年6 月24 日,全球感染病例近千万,死亡近50 万人。 我国在较短时间内完成了该病毒的鉴定和基因组测序工作,国际病毒专家小组将此次爆发的新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2[1]。 冠状病毒为有包膜的单股正链RNA 病毒,具有跨物种传播和宿主适应性强等特点。Enserink 等在国际上首次提出2003 年的SARS 冠状病毒来自蝙蝠,后通过果子狸传播给人类[2]。 本次新型冠状病毒溯源及可能的动物中间宿主还不明确,其在除了人类以外的动物中感染情况还不清楚,目前疫情防控重点主要放在人上,而对动物的防控是盲区,动物体内如果存在病毒会对疫情的防控产生巨大威胁。 本研究对实验小鼠、大鼠、豚鼠、兔及犬中新型冠状病毒的感染情况进行了初步调查,为实验动物相关从业人员的防护提供基础数据,同时对防范新冠病毒的传播提供一定的依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验动物血清均来自2020 年各实验动物生产单位送检样品[SCXK(京)2017-0005][SYXK(京)2017-0013],其中小鼠血清90 份,编号M1 ～M90;大鼠血清38 份,编号R1 ～R38;豚鼠血清20 份,编号G1～G20;兔血清27 份,编号Ra1 ～Ra27;犬血清5 份,编号C1 ～C5,详细信息见表1,已通过本院伦理审批(中检动(福)第2019(A)001 号)。

1.2 主要试剂与仪器

新型冠状病毒( SARS-CoV-2) 双抗原夹心ELISA 抗体检测试剂盒为洛阳普泰生物技术有限公司生产( 2019 兽药GMP 证字16016 号), 批号:E22A2002S。 酶 标 仪( 美 国Thermo 公 司, 型 号MK3);恒温培养箱(日本三洋公司,型号MIR-262)。

1.3 实验方法

1.3.1 ELISA 测定实验动物血清中新型冠状病毒抗体

按照ELISA 试剂盒的操作说明检测实验动物血清样品中的新型冠状病毒抗体,具体步骤如下:

a.加样:取抗原包被板,每板设阴性对照3 孔,阳性对照2 孔和空白对照1 孔,分别在相应孔中加入待测样品100 μL,阴、阳性对照每孔加入50 μL,记录样品加样顺序。

b.温育:封板膜封板,37℃温育30 min。

c.洗板:揭掉封板膜,每孔加满洗液,静置30 s,弃掉,重复洗板5 次,最后一次尽量扣干。

d.加酶:每孔加入酶标试剂100 μL,空白孔除外,37℃温育30 min。

e.洗板:同步骤c。

f.显色:每孔加入显色剂A、B 液各50 μL,轻轻振荡混匀,37℃避光显色15 min。

g.测定:每孔加入终止液50 μL,轻轻振荡混匀,设定酶标仪测定波长450 nm,用空白孔调零后测定各孔A 值。

1.3.2 结果判定

阴性对照孔A 值<0.1,阳性对照孔A 值>0.19,实验成立;临界值= 0.16+阴性对照孔A 值均值(阴性对照孔低于0.03 按0.03 计算),样品A 值≥临界值判为新冠病毒抗体阳性,样品A 值<临界值判为新冠病毒抗体阴性。

2 结果

ELISA 结果见表2,阳性对照均值为0.588,阴性对照均值为0.006,实验成立;计算临界值= 0.19,根据临界值判断90 份小鼠、38 份大鼠、20 份豚鼠、27 份兔及5 份犬血清样本中新冠病毒抗体均为阴性。

3 讨论

ELISA 检测病毒抗体是实验动物国家标准常用的病毒检测方法。 ELISA 具有灵敏度高,特异性好,操作简便等特点,对动物血清中病毒抗体检测可显示动物的既往感染情况,并可避免病毒潜伏感染造成的核酸检测假阴性结果。 近期北京新增多个病例核酸检测阴性,而抗体检测阳性,均可能由于人体免疫系统对病毒进行了一定程度的清除,此时对咽拭子样本进行核酸检测就可能出现核酸检测结果阴性。

本研究采用的ELISA 检测试剂盒来自洛阳普泰生物技术有限公司,该公司通过了兽药GMP 认证(2019 兽药GMP 证字16016 号)。 试剂盒采用双抗原夹心法检测病毒抗体,特异性良好,与小鼠肝炎病毒、大鼠冠状病毒等冠状病毒属病毒均无交叉反应。 试剂盒相关内容已制定成团体标准 “T/ CVMA 15-2020 新型冠状病毒动物血清抗体双抗原夹心酶联免疫吸附实验检测方法”,且生产单位参与了标准的制定,其检测性能可靠。 不过抗体检测也有其局限性,如抗体的产生依赖于动物的免疫状态,不适用于免疫缺陷动物的检测;同时抗体的产生需要窗口期,在窗口期检测会出现假阴性结果,因此后续的实验还需结合核酸检测进行研究。

本实验检测的样品既包含了常用品系动物,如KM、BALB / c 小鼠,SD、Wistar 大鼠等,也有各种模式动物,结果显示新冠病毒抗体均为阴性。 推测可能的原因之一是这些种类的动物机体细胞无新冠病毒受体,因而对新冠病毒不易感。 由于新冠病毒的强致病性和感染性,操作活病毒需要生物安全3级以上实验室,目前还未有实验动物人工感染新冠病毒的报道;另一原因可能在于实验动物是一类特殊群体,饲养环境、微生物状况、饲养人员、饲料和垫料等均严格控制,获得感染的几率很小,故新冠病毒抗体为阴性。

表1 实验动物样本详细信息Table 1 Information for laboratory animal samples

表2 实验动物血清中新冠病毒抗体ELISA 检测结果Table 2 ELISA test results of anti-coronavirus antibody in serum of experimental animals