microRNAs在口腔扁平苔藓中的作用及机制

杨亦婕， 葛姝云

上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔黏膜科，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海（200011）

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种常见的口腔黏膜慢性炎症性疾病，OLP 长期糜烂病损有恶变可能，世界卫生组织将其列入潜在癌前状态的范畴。研究证实了1.14%的OLP 患者发生恶性转化，发展为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）［1］。目前研究认为OLP 是一种由T 细胞调控的慢性炎症性疾病，自身免疫在其发病及发展过程中占据重要地位［2］，同时固有免疫与获得性免疫可能均参与了OLP 的发病过程［3］。microRNAs（miRNAs）参与了众多疾病的发生，如肿瘤、心脏疾病、炎症性疾病等［4-5］。研究发现miRNAs 参与了头颈部鳞状细胞癌的发生发展［6］，miRNAs 或可被用于预测口腔黏膜癌前病变的风险，而重要miRNAs 的失调同样参与了OLP 的发病机理。本文从免疫及癌变两个角度，对miRNAs 在OLP 中的作用进行综述，以期为进一步研究OLP 的发病和癌变机制、治疗方法提供参考。

1 miR-146a

Yang 等［7］研究发现，miR-146a 在OLP 患者的口腔黏膜中高表达。叉状头转录因子3（forked head transcription factor 3，Foxp3）蛋白是调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）的关键调控因子，该分子可调控外周T 细胞介导的免疫应答，包括预防自身免疫、维持Tregs 的存活。Wang 等［8］发现，转染miR-146a mimic 后，角化细胞的增殖和凋亡均有显著提高，提示miR-146a 可独立调控OLP 中人口腔角化细胞（human oral kerationocytes，HOKs）的增殖和凋亡；进一步研究发现miR-146a 可直接靶向肿瘤坏死因子受体相关因子6（TNF receptor associated factor 6，TRAF6）的3’-UTR 以抑制其表达。TRAF6是固有免疫和适应性免疫的重要调控因子，在调控T 细胞分化方面必不可缺，而在OLP 中TRAF6呈显著低表达。此外，研究人员沉默Foxp3 后，发现miR-146a 表达明显下调，而TRAF6 的表达显著增加，同时外周血Tregs 的数量显著降低。

以上实验结果均提示，Foxp3 可能通过上调miR-146a 的表达来促进OLP 患者Tregs 的增殖，且Foxp3/miR-146a/TRAF6 通路的激活可显著提高HOKs 的增殖和凋亡。该结果也验证了OLP 中Tregs 数量增加、功能缺陷的猜想，提示自身免疫性因素在OLP 发病中的重要地位。OLP 中Foxp3/miR-146a/TRAF6 通路的异常激活不仅为解释OLP 的发病机理提供了更多的实验依据，并且可能为OLP的诊断和治疗提供了一个新的生物靶点。

2 miR-26b

miR-26b 的过表达可抑制细胞增殖，miR-26b在OLP 中的的低表达可能参与疾病的发生［9］。Danielsson 等［10］研究发现环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）可被miR-26b 抑制。在正常口腔黏膜样本中，除上皮下结缔组织中的炎症细胞内可发现COX-2 的表达外，并未检测到任何COX-2 的表达；而在OLP 样本中，不仅在结缔组织的炎症细胞中发现了COX-2 的表达，在上皮基细胞层也发现COX-2 的mRNA 水平显著升高及miR-26b 的显著低表达。不仅是OLP，在多种肿瘤（包括头颈鳞状细胞癌）和自身免疫性疾病中，COX-2 均呈高表达。COX-2 可催化合成前列腺素（PG）和血栓素，从而与炎症反应直接相关并可参与肿瘤的发展。因此，研究者认为，miR-26b 的低表达及COX-2 的高表达在OLP 中发挥了重要作用。miR-26b 作为COX-2 的抑制剂，可能是OLP 潜在的治疗靶点。

3 miR-155 与miR-19a

miR-155 与炎症、肿瘤、免疫调节均密切相关。miR-155 的表达与细胞因子释放正相关，是首个被认定为原癌基因的miRNA。miR-155 不仅通过调控巨噬细胞、DCs、NK 细胞参与了固有免疫过程，其还与T 细胞、B 细胞的生存凋亡、分化、应答相关。Liang 等［11］发现miR-155 参与调节辅助性T细胞（helper T cells 1/helper T cells 2，Th1/Th2）的平衡，从而调控哮喘的发生，提示miR-155可能与自身免疫紊乱相关。Ma 等［12］也发现miR-155 与OLP相关细胞因子间联系紧密，提示其可能参与OLP 的发病过程。Wang 等［13］发现OLP 中miR-19a 高表达、miR-155 低表达；同时Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR2）的表达降低，而内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表达显著升高；miR-19a 直接靶向TLR2，而miR-155 直接靶向eNOS。miR-155/eNOS 以及miR-19a/TLR2 可分别导致白细胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5、IL-10 的减少以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）的增多，影响Th1/Th2 的 平 衡。Navarathna 等［14］发 现eNOS 及其代谢产物NO 可通过维持Th1 和Th2 之间的平衡来控制炎症反应；TLR2 可通过诱导Th1/Th2 的失衡来促进炎症反应。

以上证据均提示，miR-155/eNOS 及miR-19a/TLR2 可影响炎症因子的分泌、使Th1/Th2 失衡，从而参与OLP 的发病、增加其危险程度。在糜烂型OLP 的CD4+ T 细胞中，miR-155 可增强IFN-γ 的信号转导，而诱导IFN-γ 表达也可促进miR-155 表达［15］。这说明糜烂型OLP 的CD4+ T 细胞中存在miR-155/IFN-γ 的正反馈环路，该正反馈环路可能作用于Th1 主导的免疫反应。这些结果均说明了miR-155 及miR-19a 可能通过使自身免疫紊乱而参与OLP 发病过程，促进miR-155 表达及抑制miR-19a 表达可能是OLP 的潜在治疗方法之一。

4 miR-125a

在系统性红斑狼疮的活化T 细胞中，miR-125a被发现通过靶向Kruppel 样因子13（Kruppel like factor 13，KLF13）负调控CC 类趋化因子5（CC chemokine ligand 5，CCL5）的表达［16］，参与疾病的进程。而在OLP 患者的外周血单核细胞中，Hu 等［17］同样发现了miR-125a 低表达及CCL5 高表达。趋化因子CCL5 在T 细胞的浸润和活化中必不可少，CCL5 与其受体趋化因子受体5（chemokine receptor 5，CCR5）、CCR3、CCR1 的结合可募集并活化T 细胞，且CCR5 在Th1 细胞上特异性表达，Th1 细胞因子IL-2、IFN-γ 可上调CCR5 的表达，而Th2 细胞因子如IL-4 则可下调其表达。OLP 患者低表达miR-125a 而血浆CCL5 和CCR5+CD4+T 细胞的数目均升高，说明在OLP 中可能存在与系统性红斑狼疮相似的异常通路且此miR-125a/CCL5/CCR5 异常通路可能参与OLP 的异常免疫应答。

5 miR-125b

研究发现，miR-125b 在OLP 中的表达降低，且miR-125b 的低表达可预示OSCC 患者预后不良［18］。Wang 等［18］使用脂多糖诱导角化细胞HaCaT产生炎症介质以模拟OLP 病变的体外炎症模型，发现miR-125b 过表达抑制了基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）的表达，且miR-125b 直接靶向MMP-2 的3'-UTR。而miR-125b 的高表达不仅抑制了HaCaT 的增殖，还促进了HaCaT的凋亡。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是细胞增殖、肿瘤侵袭、血管生成的潜在关键调控因子。因此，miR-125b 的低表达和MMP-2 的高表达可能均参与了OLP 的癌变过程。miR-125b 可通过磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路来抑制OLP 的病理进程。Akt 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是mTOR 的重要调控因子，可通过PI3K 依赖的方式被激活，而Akt/mTOR 是多种肿瘤中最常见的异常通路之一。Wang 等［18］发现在HaCaT 中，miR-125b 抑制了Akt 的磷酸化以及其下游的mTOR，提示了miR-125b 的低表达促使PI3K/Akt/mTOR 信号通路异常激活。即miR-125b/PI3K/Akt/mTOR 信号通路的异常状态可能促进OLP 的癌变过程。因此，抑制该通路的异常激活也是潜在的治疗靶点。

6 miR-27b

miR-27b 与人角化细胞体内外的分化相关，也被认为是一种肿瘤抑制物［19］。研究发现OLP 患者上皮中miR-27b 低表达，其表达量与OLP 疾病活动度相关［20］，miR-27b 的下调可能是OLP 发展中相对早期的事件。研究发现，miR-27b 的下调促进口腔黏膜角化细胞（human oral keratinocytes，HOKs）生长，而上调miR-27b 则抑制HOKs 生长［21］，miR-27b可以直接抑制plk2-3’UTR，并可通过转录后调控抑制polo 样激酶2（polo-like kinase 2，PLK2）的mRNA 和蛋白表达。miR-27b 在HOKs 中的低表达可能通过上调PLK2，直接诱导细胞增殖，从而参与了OLP 的癌变过程。

7 miR-137

近年来，多项研究证明DNA 启动子甲基化通常是癌变过程（包括口腔癌）中的早期事件［22］。在多种实体肿瘤中表现出肿瘤抑制潜能的miR-137基因中含有一个广泛的CpG 岛，且在多种癌症中发现了这些区段的甲基化［23-25］。抑癌基因p16 在调控细胞周期方面发挥重要作用，p16 启动子的甲基化激活p16 从而导致了多种恶性癌变（包括OSCC）的发生［26］。

研究者发现OLP 患者口腔黏膜组织miR-137和CD8 的表达量呈负相关，且不同的OLP 亚类中两者的相关系数不同：糜烂型OLP 中为-0.250，萎缩型OLP 中为-0.491，乳头状/网纹型/花斑型OLP中为-0.616［27］。说明miR-137 可能具有抗炎或免疫调节功能。在一项更早的研究中，Dang 等［28］发现，相较健康组无甲基化的情况，OLP 组患者的miR-137 和p16 均发生了甲基化，但OLP 患者两者甲基化的发生率均低于OSCC 患者：OLP 患者miR-137和p16 甲基化发生率分别为35%和25%，OSCC 患者miR-137 和p16 甲基化发生率分别为58.3%和50%；健康组甲基化发生率均为0%；并且健康组和患者间的甲基化水平差异均有统计学意义，但OLP组和OSCC 组间的甲基化水平差异无统计学意义。这种异常的甲基化很可能导致miR-137 的低表达，miR-137 的低表达可能与OLP 的恶变相关。miR-137 启动子的异常甲基化有可能用作OLP 患者后续随访过程中的恶性预测生物标志物。

在口腔黏膜病变的恶变过程中，上皮和皮下结缔组织的关联也引起了研究者们的注意。研究发现p16 和miR-137 基因的甲基化仅可见于OLP 患者的上皮中，而在结缔组织中不可见，提示OLP 的早期恶变可能起源于上皮组织［26］。

8 小 结

miR-155、miR-125a 在OLP 中的异常表达及其功能证明了Th1/Th2 失衡可能参与OLP 的发生；而Foxp3/miR-146a 的调节则说明了OLP 中存在Tregs数量及功能异常。参与OLP 癌变的miRNAs 与OSCC 相关的miRNAs 重合度较高，间接说明了OLP 与口腔鳞状细胞癌的相关性（图1）。此外，鉴于部分miRNAs 的表达量与OLP 严重程度相关，miRNAs 的异常表达或许可被用于判断OLP 的风险、活动度及预后状况，使用miRNA 来预测疾病的发生已有先例［29］。

图1 miRNAs 对口腔扁平苔藓作用机制Figure 1 Roles of miRNAs in oral lichen planus

近几年来，针对miRNAs 的药物研究一直是医学领域的研究热点之一［30］。miRNAs 参与了多种疾病的发生，靶向miRNAs 的药物具有一定的治疗潜力，其针对的疾病包括了肿瘤、病毒感染等［31-33］。目前，对miRNA 的研究已从实验室进入到临床阶段，例如最早进入临床研究阶段的药物Miravirsen，其可同miR-122 的5’端互补治疗HCV 感染［34］，其目前正处于Ⅱa 期临床研究阶段。在肿瘤治疗领域，进展最快的药物为mRNA 类似物MRX34。在小鼠模型中，研究人员观测到了MRX34 纳米颗粒在肿瘤组织中的富集及显著缩小肿瘤组织，尽管其在I 期临床试验中取得了一定疗效，但由于免疫相关的负面事件，该临床项目被终止［35］。以上成果均说明了miRNAs 疗法具有巨大的治疗潜能，而对于目前仍没有最佳治疗方案的OLP 而言，其发病及癌变过程中的各种miRNAs 异常表达均为潜在的治疗靶点。然而，鉴于免疫反应的机制尚不明确，后续需进行更深入的临床前研究，关注miRNAs 疗法的免疫相关毒性。