辣椒5个栽培种苗期耐冷性差异评价

钱恒彦,潘宝贵,刁卫平,戈 伟,郭广君,刘金兵,陈学好,王述彬*

(1.扬州大学 园艺与植物保护学院,江苏 扬州 225009;2.江苏省农业科学院 蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏 南京 210014)

辣椒(Capsicumspp.)起源于中南美洲热带地区,包含5个栽培种和22个野生种,其中5个栽培种分别为一年生辣椒(C.annuum)、中国辣椒(C.chinense)、浆果状辣椒(C.baccatum)、灌木状辣椒(C.frutescens)和绒毛辣椒(C.pubescens)[1]。辣椒为我国第一大蔬菜作物,冷害是我国保护地辣椒生产中主要的逆境因子[2]。选用耐冷辣椒品种为抵御冷害的有效措施之一,鉴定评价耐冷材料则为辣椒耐冷育种的首要任务[3]。

C.annuum通常具有优良的农艺性状,是我国辣椒生产的主要栽培种类型[4]。在前人研究中,施加冷害胁迫条件,通过种子发芽指标(如发芽势、相对发芽指数)、冷害指数、抗氧化酶(如SOD、POD、APX)活性、脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量等指标,对C.annuum材料进行鉴定评价,并筛选出一批耐冷材料[5-9]。

研究结果表明,许多抗病、抗逆基因存在于C.chinense、C.baccatum、C.frutescens和C.pubescens这4个栽培种中；研究者通常采用种间杂交方法,将这4个栽培种的优异基因导入C.annuum,如抗炭疽病基因[10]、抗CMV基因[11]等,但与这4个栽培种耐冷性相关的研究与利用仍较少。

我们以分属于5个栽培种的14份辣椒自交系为试验材料,采用模糊隶属函数分析方法,对辣椒苗期的耐冷性进行了综合评价,以期筛选出耐冷性较强的辣椒材料,为深入研究辣椒的耐冷机理和材料创制提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究供试材料共有14份(见表1),其中A136、A270和P70为一年生辣椒(C.annuum), PI632927、PI596055和PI281320为浆果状辣椒(C.baccatum), PI241650和Grif9238为中国辣椒(C.chinense), PI439512、PI439521和PI585251为灌木状辣椒(C.frutescens), PI585270、PI593617和PI593632为绒毛辣椒(C.pubescens)。

表1 供试的14份辣椒材料的来源

1.2 冷胁迫处理

试验在江苏省农业科学院高效园艺作物遗传改良重点实验室进行。于2018年10月23日播种,50孔穴盘育苗,待幼苗长至4叶1心时,采用直径15 cm、高12 cm的塑料花盆移栽,移入人工气候室进入适应性生长,温度为25 ℃/20 ℃(昼/夜)，光周期为12 h/12 h，光照强度为4000 lx，相对湿度为65%～70%。在适应生长7 d后,采用4 ℃±1 ℃进行冷胁迫处理,光周期、光照强度和相对湿度与适应生长期相同。

1.3 生理指标测定

分别在冷胁迫处理0、6、12、24、48 h时,采集同一部位去除叶脉的真叶,放入液氮速冻,于-80 ℃冰箱保存。每个重复采样3株,混合取样,于冰上操作,每个重复称重0.1 g,3次生物学重复。采用北京索莱宝科技有限公司的试剂盒测定SOD活性(货号BC0170)、POD活性(货号BC0090)、MDA含量(货号BC0020)、氧自由基(OFR)产生速率(货号BC1290)、过氧化氢(H2O2)含量(货号BC3590),采用南京建成生物工程研究所的试剂盒检测Pro含量(货号A107-1-1)。计算变异系数，其计算公式为：变异系数=标准偏差/平均值×100%。

1.4 数据处理

应用模糊数学隶属函数分析法计算隶属函数值[12]及平均隶属度[13]。对SOD、POD、Pro采用以下公式计算隶属函数值：隶属函数值=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。对MDA、H2O2采用以下公式计算隶属函数值：隶属函数值=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。式中:Xij表示i材料j指标的测定值；Xjmin和Xjmax分别表示所有材料j指标的最小值和最大值；j表示某项指标。

采用Microsoft Office Excel 2010整理数据,应用DPS 7.05软件进行数据处理、作图和相关性分析,采用Tukey法进行多重比较分析,采用聚类分析法、隶属函数法进行耐冷性分级评价。

2 结果与分析

2.1 冷胁迫对辣椒耐冷性的影响

当植物受到冷胁迫时,其抗氧化酶会清除植物体内的氧自由基,Pro含量会升高,有助于细胞组织保持含水量,防止植株脱水死亡。随着冷胁迫时间的延长,植物体内H2O2含量及OFR产生速率都会增加,抗氧化酶无法及时清除,最终导致膜质过氧化。本研究结果(表2)表明,在冷胁迫处理48 h内,SOD活性总体呈现先上升再下降的趋势,在6 h时达到峰值,且与0 h相比差异显著(P<0.05)。POD活性在冷胁迫处理48 h内均值都高于0 h,且在12 h时达到最高,为1709.37 U/g。Pro含量在冷胁迫处理0～24 h期间下降,在24～48 h期间升高,且在冷胁迫48 h时较0 h上升0.07 μg/g。H2O2含量在冷胁迫0～12 h期间下降,在12～48 h期间升高。OFR产生速率在冷胁迫处理期间始终高于0 h时的。MDA含量在冷胁迫处理6 h时达到最大值61.98 nmol/g。

表2 不同时间冷胁迫处理对辣椒幼苗生理指标的影响

2.2 辣椒耐冷性鉴定的适宜胁迫时间

由表3可知,不同时间冷胁迫处理辣椒6项生理指标的变异系数差异较大,其中SOD活性、MDA含量和Pro含量这3项指标以12 h处理的变异系数最大,分别为0.31%、0.71%、0.49%,表明12 h冷胁迫处理能较好地反映不同辣椒材料间耐冷性差异。

表3 不同时间冷胁迫处理辣椒幼苗6项生理指标的变异系数

2.3 辣椒栽培种间耐冷性的差异

对4 ℃±1 ℃处理12 h的5个栽培种的生理指标进行分析，结果(表4)表明：3份C.annuum材料SOD活性的平均值最高(306.08 U/g)；3份C.pubescens材料POD活性的平均值最高(2508.43 U/g)；2份C.chinense的MDA含量最低(10.30 nmol/g)；3份C.pubescens材料的Pro含量比2份C.chinense材料高出8.98 μg/g；H2O2含量和OFR产生速率最低的栽培种分别为C.chinense和C.frutescens；3份C.pubescens材料的MDA含量比2份C.chinense材料高出39.15 nmol/g。在本研究分属于辣椒5个栽培种的14份材料间，SOD活性、POD活性、Pro含量、H2O2含量、OFR产生速率均无显著差异。

表4 冷胁迫处理12 h辣椒栽培种间生理指标的差异

2.4 辣椒耐冷性指标间的相关性

对冷胁迫处理12 h辣椒幼苗的6项生理指标进行相关分析,结果(表5)表明:SOD活性与POD活性呈显著负相关(r2=-0.52*);MDA含量与POD活性呈极显著正相关(r2=0.76**);POD活性与H2O2含量呈显著正相关(r2=0.61*);MDA含量与Pro含量呈显著正相关(r2=0.53*);Pro含量与H2O2含量呈极显著正相关(r2=0.79**)；OFR产生速率与其他5个生理指标间无显著相关性。说明冷胁迫对辣椒幼苗的生理影响是多方面的。

表5 冷胁迫处理12 h辣椒幼苗生理指标间的相关性

2.5 辣椒材料耐冷性的综合评价

选取SOD活性、POD活性、Pro含量、MDA含量、H2O2含量5项生理指标(表6),采用隶属函数法,对14份辣椒材料苗期的耐冷性进行综合评价。由表6可知：C.annuumP70、C.annuumA270、C.chinensePI241650的平均隶属度分别为0.63、0.59、0.58,具有较强的耐冷性;C.frutescensPI439521、C.baccatumPI632927、C.pubescensPI593632的平均隶属度分别为0.43、0.46、0.46,耐冷性中等;C.pubescensPI593617的平均隶属度为0.32,耐冷性较弱。

表6 不同辣椒材料耐冷性相关指标的隶属函数值

2.6 辣椒幼苗耐冷性的聚类分析

采用类平均法(UPGMA),对经4 ℃±1 ℃处理12 h的14份辣椒材料的平均隶属度进行聚类分析,结果如图1所示。在欧式距离0.09处,将14份材料分为3个类别：第Ⅰ类别包括5份材料,分别为C.annuumP70、C.annuumA270、C.chinensePI241650、C.annuumA136和C.frutescensPI439512,占供试材料的35.71%,在冷胁迫处理12 h时植株表现为叶片下垂,无明显失水症状,在冷胁迫处理24 h时植株表现为叶片下垂,无明显失水症状;第Ⅱ类别包括C.baccatumPI632927、C.frutescensPI439521、C.chinenseGrif9238等8份材料,占供试材料的57.14%,在冷胁迫12 h时植株表现为叶片边缘轻微失水,在冷胁迫24 h时表现为除顶部真叶外,其余真叶失水较为严重并出现水渍化现象,其中C.chinenseGrif9238在冷胁迫12 h、24 h时叶片出现褐斑;第Ⅲ类别仅包括C.pubescensPI593617这1份材料,占供试材料的7.14%,其在冷胁迫12 h时植株叶片出现水渍,并出现褐斑,在冷胁迫24 h时植株水渍化更加严重,褐斑增多。5个栽培种代表材料在冷胁迫后的植株表现结果见图2。

图1 14份辣椒材料苗期耐冷性的聚类分析结果

图2 5个辣椒栽培种代表材料在冷胁迫后的表型变化

3 小结与讨论

适当时间的冷胁迫处理是评价辣椒苗期耐冷性的一个重要因素。徐冉等以冷胁迫(15 ℃/8 ℃)处理辣椒幼苗,在冷胁迫处理10 d时辣椒幼苗的POD活性、Pro含量均达到最大值[14];经4 ℃冷胁迫处理48 h,耐冷材料‘湘研1号’叶片中的MDA含量呈上升趋势,SOD活性高出处理前25.15%[15];经5 ℃冷胁迫处理15 d辣椒材料‘良椒2313’的SOD活性、POD活性、Pro含量、MDA含量在4份材料中最高[16]。前人模拟低温进行耐冷性鉴定,通常采用单一时间处理,得到的试验结果对耐冷性鉴定及耐冷机制分析具有一定的局限性。本试验比较了辣椒苗期在冷胁迫处理中5个时间段的生理指标变异系数,发现在冷胁迫处理12 h时,3项生理指标SOD、MDA、Pro的变异系数最大,表明4 ℃±1 ℃冷胁迫处理12 h可以较好地反映出辣椒材料的耐冷性差异。

不同植物抵抗低温的能力不同,致使低温会对植物造成不同程度的损伤[17],严重时可导致植株死亡。辣椒苗期在受到冷胁迫时,细胞膜透性增加[18],细胞保护酶活性被抑制,从而降低对活性氧和自由基的清除,导致膜脂过氧化产物MDA的增加[19]；而Pro作为渗透调节物质能够增加胞内溶质浓度,降低冰点,从而降低冷害对幼苗的伤害[20]。宋静爽等[21]以辣椒低温敏感型C.annuum‘A122’和耐低温型C.annuum‘A188’为试验材料,发现在4 ℃冷胁迫72 h内,其SOD活性以及Pro含量随胁迫时间延长呈上升趋势,而POD活性和MDA含量则先升高后降低;张武君等[22]以防城普通种‘金花茶’为材料,在3 ℃下低温胁迫处理3～12 h，发现SOD活性呈下降趋势,POD活性在3～6 h期间下降,在6～12 h期间上升,而Pro含量和MDA含量均呈上升趋势;对4份番茄材料进行15 ℃/5 ℃、20 ℃/10 ℃冷胁迫处理，发现随着温度降低,番茄幼苗的SOD活性呈下降趋势,而POD活性、MDA含量、Pro含量呈上升趋势[23]。本研究发现：在冷胁迫处理48 h内,辣椒幼苗的SOD活性总体上呈现先上升再下降的趋势;POD活性在冷胁迫处理48 h内均值都高于0 h时的;Pro含量在冷胁迫处理0～48 h期间呈现出先降低后升高的趋势;H2O2含量在冷胁迫6 ～24 h期间呈下降趋势,在24～48 h期间升高;OFR产生速率始终高于0 h时的;MDA含量在冷胁迫处理6 h时达到峰值后下降。本研究结果与前人的研究结果不尽相同,这可能与作物本身的生物学特性以及胁迫温度和胁迫时间的长短有关。

植物的耐冷性是受多基因控制的数量性状,耐冷机制十分复杂[24-25]。为了全面评价辣椒幼苗的耐冷性,应结合多个指标科学地评价幼苗的耐冷性[26]。使用隶属函数法进行多项指标的综合评价是目前普遍认为可靠的抗逆评价方法,该方法常用于辣椒[18]、黄瓜[27]、马铃薯[28]等作物的抗逆性评价。苗丽等采用隶属函数法对102份嫁接黄瓜进行了评价,筛选出‘柿饼南瓜5Bb636-3(N67)’和‘三禾13-s08z13-3(N91)’等作为优异亲本材料[29]。齐晓华等[30]采用隶属函数法,从8份华北型黄瓜品种(系)中筛选出2份强耐冷的品系材料‘NY4’、‘NY5’和1份耐冷品种‘科普2号’。本实验室丁梦佳等对44份辣椒材料在苗期与成株期的耐冷性进行了综合评价,筛选出耐冷材料C.annuum‘A270’[31]。在本试验中,C.annuum‘P70’、C.annuum‘A270’、C.chinense‘PI241650’、C.annuum‘A136’、C.frutescens‘PI439512’的平均隶属度居前5位,在14份材料中表现出了较强的耐冷性。本研究实验材料的平均隶属度在闭区间[0～1]范围内,利用平均隶属度能比较准确地评价辣椒的耐冷性。

辣椒是世界性蔬菜作物和调味品,生产上的品种基本上都是C.annuum,因此前人研究辣椒耐冷性的试验材料主要来自C.annuum,同时对C.annuum、C.chinense、C.baccatum、C.frutescens和C.pubescens这5个栽培种的耐冷性研究很少。本研究为了充分挖掘辣椒的耐冷基因,率先开展了辣椒5个栽培种的耐冷性综合评价研究,除了在C.annuum中获得了3份耐冷材料外,还在C.chinense和C.frutescens中分别获得了1份耐冷材料。本研究扩大了辣椒耐冷的基因库,这对后续辣椒耐冷机制的深入研究和耐冷材料的创制具有积极作用。

本研究结果表明：冷胁迫处理12 h可以较好地反映出辣椒5个栽培种14份材料苗期的耐冷性差异,因此12 h为辣椒冷胁迫处理的适宜时间；POD与SOD、MDA、H2O2间,Pro与MDA、H2O2间均存在显著相关性；用隶属函数法对SOD、POD、MDA、Pro、H2O2这5项生理指标进行综合评价,得到耐冷材料C.annuum‘P70’、C.annuum‘A270’、C.annuum‘A136’、C.chinense‘PI241650’、C.frutescens‘PI439512’。