U18666A对星形胶质瘤U373细胞APP代谢及Aβ生成的影响

2020-10-09 10:32杨宏艳都晓辉包亚男
中国医药导报 2020年22期
关键词:胆固醇

杨宏艳 都晓辉 包亚男

[摘要] 目的 观察胆固醇转运抑制剂U18666A(UA)对星形胶质瘤U373细胞淀粉样前体蛋白(APP)代谢及β淀粉样蛋白(Aβ)生成的影响。 方法 0、1、3、5 μg/mL UA 作用U373细胞24 h,或5 μg/mL UA与U373细胞共培养0、12、24、48 h,Western blot检测APP及其代谢产物α-CTF、β-CTF的表达,酶联免疫吸附试验检测细胞内Aβ1-40含量,荧光酶法检测β-分泌酶活性。 结果 3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达水平、β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA组,差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。共培养24、48 h组APP表达水平、β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于共培养0 h组,差异均有高度统计学意义(均P < 0.01)。5 μg/mL UA组β-分泌酶活性高于对照组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。 结论 UA通过增加β-分泌酶活性增强APP的表达和代谢,促进Aβ1-40的生成,加速阿尔茨海默病进程。

[关键词] 胆固醇;U18666A;U373细胞;淀粉样前体蛋白;β淀粉样蛋白

[中图分类号] R749.16          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210(2020)08(a)-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of cholesterol transport inhibitor U18666A (UA) on amyloid precursor protein (APP) metabolism and β-amyloid protein (Aβ) generation in U373 cells of astroglioma. Methods U373 cells were treated with UA at the dose of zero, one, three and five μg/mL for 24 h or 5 μg/mL UA for different times (0, 12, 24, 48 h). The expressions of APP and its metabolites α-CTF and β-CTF were detected using Western blot. The cellular levels of Aβ1-40 were measured with enzyme linked immunosorbent assay and the activity of β-secretase was determined by fluorescence assay. Results The expression levels of APP, α-CTF and β-CTF, and Aβ1-40 in 5 μg/mL UA group were higher than those in 0 μg/mL UA group, and the differences were statistically significant (P < 0.05 or P < 0.01). The expression levels of APP, α-CTF and β-CTF, and Aβ1-40 in co-cultured 24 h and 48 h groups were significantly higher than those in co-cultured 0 h group, and the differences were highly statistically significant (all P < 0.01). The activity of β-secretase in 5 μg/mL UA group was significantly higher than that in the control group (P < 0.01). Conclusion UA enhances APP expression and metabolism by increasing β-secretase activity, promotes Aβ1-40 generation, accelerates the pathological process of Alzheimer′s disease.

[Key words] Cholesterol; U18666A; U373 cell; Amyloid precursor protein; β-amyloid protein

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,患者脑内有明显的β淀粉样蛋白(Aβ)沉积。Aβ主要由淀粉样前体蛋白(APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶水解产生[1-2]。胆固醇水平偏高患者AD发病风险明显升高[3-6],胆固醇代谢与AD关系是研究AD发病机制的一个热点。本研究以星形胶质瘤U373细胞为研究对象,加入不同剂量胆固醇转运抑制剂U18666A(UA)作用不同时间,观察UA对U373细胞APP代谢及Aβ生成的影响,为进一步理解胆固醇代谢与AD关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Thermo 3001酶标仪(Thermo);Power Poc Basic电泳仪(Bio-Rad);ChemiDoc MP全功能荧光化学发光成像仪(Bio-Rad);UA[爱必信(上海)生物科技有限公司,MZ28];Y188抗体(Abcam,ab32136);Aβ1-40试剂盒(Life Technologies,KHB3482);β-分泌酶活性荧光检测试剂盒(Abcam,ab65357);β-actin抗体(ZM-0001)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(ZDR-5403)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(ZB-2305)均购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养  U373细胞(上海生命科学院细胞资源中心)培养在10% FBS的DMEM培养基中,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。每2~3天换液一次。

1.2.2 分组药物处理  分别加入0、1、3、5 μg/mL UA作用U373细胞24 h或加入5 μg/mL UA作用U373细胞0、12、24 h和48 h。

1.2.3 Western blot测定蛋白表达  实验结束后,收集细胞,按照本研究组前期实验[7]方法提取蛋白。配制10%分离胶和5%浓缩胶,加入等量蛋白样品电泳,转至PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入Y188(1∶3000)抗体,4℃孵育过夜。TBST洗3次,二抗(1∶5000)室温孵育1 h,TBST漂洗后显影成像。Quantity-One软件分析蛋白灰度。

1.2.4 酶联免疫吸附试验检测Aβ1-40含量  收集各组细胞样品,RIPA裂解30 min,4℃、12 000 r/min离心10 min,收集沉淀。按试剂盒说明书操作,检测450 nm各孔光密度值,根据标准曲线计算细胞内Aβ1-40含量。每组2个复孔,实验重复4次。

1.2.5 荧光法检测β-分泌酶活性  5 μg/mL UA作用U373细胞24 h,弃培养基,加入100 μL提取液,冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min离心5 min,收集上清液。按试剂盒说明书依次加入样品、反应液和底物。样品分为对照组、UA组、阴性对照组(加入抑制剂)、空白组(加入培养基)。混匀,37℃避光孵育60 min,激发波长335 nm,发射波长495 nm处检测各孔荧光强度,计算β-分泌酶活性。每组设2个复孔,实验重复4次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析,符合正态分布计量资料用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UA对U373细胞APP蛋白表达的影响

0、1、3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达量比较,差异有高度统计学意义(F = 20.05,P < 0.01);3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达水平高于0 μg/mL UA组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。共培养0、12、24 h和48 h组APP蛋白表达量比较,差异有高度统计学意义(F = 19.48,P < 0.01);共培养24、48 h组APP蛋白表达水平高于共培养0 h组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见图1。

2.2 UA对U373细胞APP代谢产物β-CTF和α-CTF含量的影响

0、1、3、5 μg/mL UA组β-CTF和α-CTF蛋白表达量比较,差异有高度统计学意义(F = 31.23,P < 0.01;F = 14.35,P < 0.01);3、5 μg/mL UA组β-CTF和α-CTF蛋白表达量高于0 μg/mL UA组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。共培养0、12、24、48 h组β-CTF和α-CTF蛋白表达量比较,差异有高度统计学意义(F = 28.7,P < 0.01;F = 28.96,P < 0.01)。共培养24 h和48 h组β-CTF和α-CTF蛋白表达量高于共培养0 h组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见图2。

2.3 UA对U373细胞Aβ1-40含量的影响

0、1、3、5 μg/mL UA组Aβ1-40含量比较,差异有高度统计学意义(F = 9.181,P < 0.01)。1、3、5 μg/mL UA组Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA组,差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。共培养0、12、24 h和48 h组Aβ1-40含量比较,差异有高度统计学意义(F = 15.03, P < 0.01)。共培养24、48 h组Aβ1-40含量高于共培养0 h组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。见图3。

2.4 UA对U373细胞β-分泌酶活性的影响

5 μg/mL UA组β-分泌酶活性高于对照组,差异有高度统计学意义(t = 9.942,P < 0.01)。见图4。

3 讨论

胆固醇是真核细胞细胞膜的重要成分,能够维持膜结构完整性,参与信号转导,促进神经元的发展,维持突触的弹性和功能,在AD的发生发展过程中起重要作用[3,8-12]。高胆固醇饮食可以使AD动物脑内Aβ聚集增多,长期服用大剂量他汀类药物可以改善临床轻中度AD患者的认知功能障碍[9,13]。AD患者及转基因动物脑中可见大量激活的星形胶质细胞,提示星形胶质细胞与AD的发生发展密切相关[14-15]。高水平的膜胆固醇可提高胞浆钙浓度,促进Aβ生成,引起神经细胞死亡[16]。UA可抑制膽固醇的转运,引起胆固醇在细胞内蓄积[17-18]。本研究观察了UA对星形胶质瘤U373细胞APP代谢的调节作用。结果显示,3、5 μg/mL UA组APP蛋白表达水平高于0 μg/mL UA组;共培养24、48 h组APP蛋白表达水平高于共培养0 h组,差异有高度统计学意义(P < 0.01)。提示UA通过改变胆固醇的水平和分布促进APP的表达,与已有报道相符[19-20]。

Aβ生成过多和细胞外沉积是AD的主要病理特征之一。APP经α-分泌酶水解生成可溶性多肽sAPPα和跨膜片段α-CTF,经β-分泌酶水解生成sAPPβ和跨膜片段β-CTF,β-CTF继续被γ-分泌酶水解生成Aβ1-40或Aβ1-42[2,19]。本研究结果显示,3、5 μg/mL UA组β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于0 μg/mL UA组;共培养24、48 h组β-CTF和α-CTF蛋白表达量、Aβ1-40含量高于共培养0 h组,差异均有高度统计学意义(均P < 0.01)。β-分泌酶是APP代谢中的关键酶,其含量和活性大小直接决定了Aβ的生成。本研究进一步检测了β-分泌酶的活性,结果显示UA明显增强U373细胞β-分泌酶的活性。

综上所述,胆固醇转运抑制剂UA增加U373细胞APP的表达,促进APP代谢及Aβ生成,其机制与增强β-分泌酶活性有关。

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(收稿日期:2020-03-18)

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