北部湾涠洲岛红色赤潮藻的分子鉴定

徐轶肖 , 何喜林 , 张 腾 , 赵志娟, 韦光领

(1. 南宁师范大学 北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室, 广西 南宁530001; 2. 南宁师范大学 广西地表过程与智能模拟重点实验室, 广西 南宁 530001; 3. 南宁师范大学 环境与生命科学学院, 广西 南宁530001)

红色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)原名红色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum), 中文又译作血红哈卡藻, 隶属于甲藻门(Dinophyta)、甲藻纲(Dinophyceae)、裸甲藻目(Gymnodiniales)、裸甲藻科(Gymnodiniaceae)、赤潮藻属(Akashiwo), 是广温、广盐性种类, 藻细胞呈五角形, 可形成休眠孢子, 具有分布广的特点[1]。2000 年Daugbjerg[2]等借助分子生物学方法指出红色赤潮藻与其他裸甲藻进化关系较远, 因此独立出来成立1 个新属, 即赤潮藻属(Akashiwo), 并把该种命名为Akashiwo sanguinea。目前在赤潮藻属下尚未命名其他新种, 所以普遍认为赤潮藻属只有1 种, 即红色赤潮藻。

红色赤潮藻赤潮暴发时海水颜色为褐色或红褐色, 迄今没有该藻产毒的报道, 但是红色赤潮藻大量繁殖引起的赤潮能够引发鱼虾类、海洋无脊椎生物的大量死亡[3]。1922 年在日本Kozusa-ura Gokasho Bay 首次记录到由红色赤潮藻引起的大规模赤潮[4],随后在英国、新西兰、美国大西洋和太平洋沿岸也发现该藻赤潮事件。1998 年8 月中旬～9 月中旬在中国烟台四十里湾第一次记录到由红色赤潮藻暴发的大规模赤潮, 面积约100 km2[5], 之后在中国南方沿海多处出现, 夏秋季多发, 现已成为中国东南沿海常见的赤潮种[6-7]。

近年来, 北部湾藻华发生频次、规模、有害赤潮种类呈增加趋势[8], 特别是北部湾经济区开发后, 藻华发生的种类发生了明显变化。2000 年前, 藻华种主要为蓝藻门(Cyanophyta)的微囊藻(Microcystis),2001～2010 年间为蓝藻、甲藻(Dinophyta)和硅藻(Bacillariophyta), 2011 年至今主要为定鞭藻门(Haptophyta)的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)[9]。但2016 年5 月北部湾钦州海域曾发生约20 km2的红色赤潮藻赤潮[10], 同一时间在防城港海域发现红色赤潮藻水色异常事件, 细胞密度高达3.44×105个/L[11]。遗憾的是, 两次事件均只是文字报道, 缺乏形态学和分子生物学数据。由于红色赤潮藻活细胞体形易变, 固定后细胞易被破坏而难以识别其形态, 是裸甲藻中较难鉴定的种类之一。分子标记技术的发展,使海洋微藻鉴定从形态学上升到DNA 分子水平, 基于SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 的DNA 序列鉴定及分子系统学研究是区分变种、地理株、物种的有效手段, 前人已成功将这些方法应用于红色赤潮藻的分子鉴定中[2,12-13]。

涠洲岛作为北部湾最大的岛屿, 是中国地质年龄最年轻的火山岛, 因其独特的地势特征及民俗风情, 有着非常高的旅游价值和地位[14]。但涠洲岛也是北部湾藻华事件的“热点”区域, 1985—2017 年,北部湾发生的 39 次藻华中, 涠洲岛占了 15 次(38.5% )[9]。藻华可能破坏海洋渔业资源和海洋生态环境, 带来严重的经济损失, 考虑到红色赤潮藻是世界分布种, 中国沿海多个海域包括北部湾都曾发生过由该藻引起的赤潮事件, 有必要弄清分离自涠洲岛形态疑似红色赤潮藻的种类。作者对涠洲岛海域非赤潮期间的6 株疑似红色赤潮藻种应用SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 特征序列进行分子鉴定, 结果可为今后北部湾及涠洲岛赤潮和海洋环境安全研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 藻种来源

2019 年6 月非赤潮期间, 在广西涠洲岛周围S1～S8 站位采集海水(图1), 具体样品采集、贮存、运输参照《海洋监测规范》(GB17378.1—2007)[15]。样品带回实验室, 在倒置显微镜(TS100-Nikon)下,根据文献报道的红色赤潮藻典型形态特征[16]: 细胞长55 µm～77 µm、宽40 µm～50 µm、上锥部钟状、下锥部具两只底角、具横沟和纵沟、纵沟未伸入上锥部、细胞核位于细胞中间。用毛细管分离法从水样中挑选疑似红色赤潮藻藻株洗涤分离并培养, 培养条件为减富K 培养基[17]、22℃、光强150 μE/(m2/s)、光暗比12 h︰12 h。本研究共在S2 和S7 站位分离获得6 株疑似红色赤潮藻纯培养株, 编号为S2-2019-Ak-1、S2-2019-Ak-2、S2-2019-Ak-3、S2-2019-Ak-4、S7-2019-Ak-1、S7-2019-Ak-2。

图1 采集地点Fig. 1 Sampling sites

1.2 藻体形态观察

取指数生长期的疑似红色赤潮藻细胞藻液。(1)因红色赤潮藻为裸甲藻中的一种, 易变形, 不适合固定后观察, 故直接吸取适量藻液在载玻片上, 光学显微镜(TS100, Nikon)下观察活体藻细胞并用拍照软件拍照(NIS-Elements D 4.50.00); (2)吸取适量藻液在载玻片上, 并加入适量的SYBR Green1 荧光染料(上海源叶生物科技有限公司)对细胞核染色, 在荧光显微镜(NI-SS, Nikon)下观察并拍照。

1.3 DNA 的提取和扩增

取指数生长期藻液, 7 000g/min 离心1 min, 倒掉上清液, 运用杭州博日BioFastSpin 植物基因组DNA 提取试剂盒对红色赤潮藻提取DNA, 以提取的总DNA 为模板进行SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 特征片段PCR扩增, 具体引物序列见表1, 其中ITS 为简并引物。PCR反应程序: 94℃预变性5 min; 然后94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共35 个循环; 最后72℃延伸5 min。PCR 产物送到北京擎科新业生物技术有限公司测序, 共获得6 条SSU rDNA、6 条LSU rDNA、6 条ITS序列, 所有序列均已提交至GenBank(表2)。

表1 引物序列信息Tab. 1 Primer sequence information

表2 红色赤潮藻SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 基因序列Tab. 2 SSU rDNA, LSU rDNA and ITS sequences of Akashiwo sanguinea

续表

1.4 数据分析

将获得的6 株疑似红色赤潮藻LSU rDNA、SSU rDNA、ITS 基因序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库进行BLAST同源性分析, 下载同源性较高的序列作为参考序列, 其中藻株CCMP1593、CCMP1837、CCMP13215、GnSg02_5、GnSg03_5 同时具有上述3 种序列(表2)。应用软件MEGA7 中的最大似然法(Maximum Likelihood, ML)构建系统发育树并计算序列间遗传距离。ML 分析时采用启发式搜索(heuristic), 建树进行1 000 次随机重复取样, 通过自展分析检验分支置信度, 抽样自展值>90%时为极显著, 70%～90%为较显著, <70%为不显著。

2 结果

2.1 藻体形态特征

光学显微镜下观察到涠洲岛疑似红色赤潮藻株营单细胞游泳生活, 游动时像落叶一样飘旋。藻细胞长69 ±4.2 μm、宽54 ±5.7 μm(n=40); 细胞中央处最宽, 具横沟和纵沟, 横沟较窄分布在中央, 把细胞分为上锥部和下锥部两部分, 上下锥部长度近似,纵沟未侵入上锥部; 上锥部呈钟状, 下锥部含有两个底角, 分为两叶呈W 形; 光学显微镜下隐约可见位于细胞中央的细胞核(浅色区)(图2A)。细胞荧光染色后, 位于细胞中央的圆形细胞核清晰可见(图2B)。上述特征与文献中描述的红色赤潮藻形态特征相符[16]。

图2 北部湾涠洲岛疑似红色赤潮藻S2-Ak-2019-1 的光学显微镜图(A)和荧光显微镜图(B)Fig. 2 Light microscopy (A) and fluorescence microscopy images (B) of putative A. sanguinea from Weizhou Island, Beibu Gulf

2.2 PCR 扩增与测序

以藻株S2-2019-Ak-1、S2-2019-Ak-2、S2-2019-Ak-3、S2-2019-Ak-4、S7-2019-Ak-1、S7-2019-Ak-2 的DNA为模板进行PCR 扩增获得SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 序列电泳图(图3), 3 种序列的电泳图均出现1 条明亮条带, 表明PCR 扩增正常, 测序所得序列长度分别约为1.7 kb、1.3 kb 和700 bp。

图3 疑似红色赤潮藻SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 序列电泳图Fig. 3 Electrophoresis map of LSU rDNA, SSU rDNA and ITS sequences of putative Akashiwo sanguinea M. Marker DL2000, 1-6. S2-2019-Ak-1、S2-2019-Ak-2、S2-2019-Ak-3、S2-2019-Ak-4、S7-2019-Ak-1、S7-2019-Ak-2

2.3 系统发育树分析

以球形棕囊藻为外类群, 构建SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 序列系统发育树, 发现北部湾涠洲岛6 株疑似红色赤潮藻与世界不同海域的红色赤潮藻聚成一大分支, 自展值分别为99、100 和100(图4—图6)。上述系统树主要包含3 个分支: (1) 本文6 株红色赤潮藻与韩国安山海域的GSW0207 藻株(SSU)、新加坡GT6 藻株(LSU)、中国厦门港GSXM02 藻株(ITS)聚在一起, 同源性较高, 自展支持值分别为93、99、84; (2) 美国海域的红色赤潮藻藻株聚成一小支, 自展值亦较高, 分别为99、99、90; (3) 其他亚洲韩国、日本和欧洲挪威、法国等海域的藻株聚成一小支, 自展值为79、92、99(图4—图6)。裸甲藻科内, 与红色赤潮藻亲缘关系最近的藻属是环沟藻属(Gyrodinium),其次是裸甲藻属(Gymnodinium)和凯伦藻属(Karenia),而与旋沟藻属(Cochlodinium)的亲缘关系较远(图4—图6)。

图4 基于SSU rDNA 序列构建的疑似红色赤潮藻系统发育树(最大似然法)Fig. 4 The Maximum Likelihood (ML) phylogenetic tree based on SSU rDNA sequences of putative Akashiwo sanguine

遗传距离计算得出, 北部湾涠洲岛六株红色赤潮藻株的SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 序列之间的遗传距离分别为0.000、0.000、0.001～0.005, 它们与亲缘关系最近的韩国安山红色赤潮藻株GSW0207(图4)、新加坡株GT6(图5)和中国厦门港株GSXM02(图6)遗传距离分别为0.001、0.003 和0.045, 而与世界其他海域的红色赤潮藻SSU、LSU、ITS 遗传距离则分别为0.001～0.008、0.003～0.025 和0.045～0.406。上述3 个序列的红色赤潮藻种内遗传距离(包括涠洲岛株)为0.000～0.010、0.000～0.028、0.000～0.406, 明显小于该藻与裸甲藻科下近缘藻属环沟藻属、裸甲藻属、凯伦藻属、旋沟藻属间的SSU、LSU、ITS 遗传距离 0.032～0.072、0.165～0.222 和0.589～1.559。因此, 系统发育树和遗传距离结果均确认本文研究的6 株涠洲岛疑似红色赤潮藻株属于红色赤潮藻。

图5 基于LSU rDNA 序列构建的疑似红色赤潮藻系统发育树(最大似然法)Fig. 5 The Maximum Likelihood (ML) phylogenetic tree based on LSU rDNA sequences of putative Akashiwo sanguine

3 讨论

红色赤潮藻是一种混合营养型甲藻, 目前虽尚无产毒报道, 但大量研究表明该藻爆发的赤潮能使大量浮游植物和水生生物死亡[21-22], 从而破坏海洋生态系统平衡和水产养殖业发展。北部湾位于中国南海西北部, 是一个半封闭海湾, 水体交换能力和自净能力差[23], 一旦发生赤潮, 很可能导致严重海洋灾害。掌握红色赤潮藻客观准确的分子序列特征及该类群的起源和生理特性是防治该藻灾害的关键。本研究对采自北部湾涠洲岛的疑似红色赤潮藻株进行形态学特征和目的基因 SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 分析, 判定6 株藻均为红色赤潮藻, 结果将为北部湾海域赤潮藻种的来源与组成, 及赤潮的发生与管理提供基础信息。

总的来说, 源自同一或邻近海域的红色赤潮藻株序列差异小, 亲缘关系较近; 而地理位置相距较远的差异大, 亲缘关系较远。红色赤潮藻北部湾涠洲岛株与亚洲海域来源的韩国安山株、新加坡株、中国厦门港株亲缘关系较近, 而与地理位置较远的美国切萨皮克海湾、美国哈灵顿海峡、美国纳拉干西特湾株红色赤潮藻亲缘关系较远。但研究也发现北部湾涠洲岛株LSU rDNA 与韩国长木海域株亲缘关系较远, 反而与地理分布较远的美国株亲缘关系更近, 类似现象在他人研究中[24-25]也有报道, 这可能反映了红色赤潮藻不同地理株在自然或人为因素影响下的入侵。3 种序列遗传距离中, SSU rDNA 最为保守, 而ITS 序列相对于SSU rDNA 和LSU rDNA序列有更大的碱基突变速率, 例如红色赤潮藻北部湾涠洲岛株与CCMP1837 藻株SSU rDNA 和LSU rDNA 序列核苷酸差异值分别为0.007 和0.022, 而与ITS 序列核苷酸差异值为0.251～0.266。因此, ITS 区域进化速率较快, 对鉴定红色赤潮藻不同株的亲缘关系有较好的参考。

图6 基于ITS 序列构建的疑似红色赤潮藻系统发育树(最大似然法)Fig. 6 The Maximum Likelihood (ML) phylogenetic tree based on ITS sequences of putative Akashiwo sanguine

本研究发现红色赤潮藻种内遗传距离超过了其他一些微藻, 如三角棘原甲藻(Prorocentrum triestinum)和纤细原甲藻(Prorocentrum gracile)的 SSU rDNA序列遗传距离为 0.001, 与慢原甲藻(Prorocentrum rhathymum)的遗传距离为 0.006[26], 南极棕囊藻(Phaeocystis antarctica)与球形棕囊藻SSU rDNA 遗传距离为0.008[27], 而红色赤潮藻SSU rDNA 种内遗传距离最大值为0.010(韩国安山GSW0207 株与美国纳拉干西特湾CCMP1593 株), 本文6 株红色赤潮藻与美国哈灵顿海峡株CCMP1837、美国纳拉干西特湾株CCMP1593 的SSU rDNA 遗传距离也达到了0.008。类似地, 本文红色赤潮藻LSU rDNA 种内遗传距离最大值0.028, 大于链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)与塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)的LSU rDNA 序列遗传距离0.005[28], ITS 遗传距离0.000～0.406 与陈月琴[29]等得出的微藻类ITS 序列核苷酸种间差异应大于0.2 也不一致。结合图4—图6的系统进化树拓扑结构, 红色赤潮藻种下仍具有3个分支, 分支具有较好的自举值79～99 支持, 且同一地理相近的藻株更易聚成一支, 说明在分子生物学鉴定上, 红色赤潮藻各个株的遗传差异较大, 赤潮藻属下红色赤潮藻存在进一步定义不同种的可能,但不同分支的红色赤潮藻究竟是否有可能划分为不同种, 还需要开展更深入的研究, 尤其需要形态学等表观特征的验证。

4 结论

作者对在北部湾涠洲岛采集到的6 株疑似红色赤潮藻株进行了种类鉴定, 光学显微镜和荧光显微镜观察其与赤潮藻属下的种类红色赤潮藻相一致。应用SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 基因序列构建系统发育树, 确定北部湾涠洲岛6 株藻均为红色赤潮藻。它们与来源自亚洲海域的韩国安山株、新加坡株、中国厦门港株序列差异小, 亲缘关系较近相近,而与地理位置相距较远的红色赤潮藻株序列差异大,亲缘关系较远。

致谢: 感谢西班牙藻类学家Santiago Fraga 对本文讨论部分的建议。