延经丸对去势模型大鼠肾上腺皮质中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

赵粉琴,李春瑶,刘晓莉,苟亚娇,胡志霞,徐世倩,袁爱倩,张文静

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 73000)

围绝经期出现潮热出汗，记忆力下降，烦躁易怒，心血管疾病以及情感障碍(抑郁或焦虑)等症状。目前普遍认为[1-2]，该症状的主因是女性卵巢功能衰退，雌激素水平低下，对下丘脑-垂体的负反馈抑制作用降低，继发垂体功能一时亢进，引起下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO轴)与下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)功能紊乱有关。

中医学认为肾脑相关，《素问·六节藏象论》《素问·五脏生成》《素问·阴阳应象大论》等篇章论述的“肾精生髓，髓通于脑”从髓的角度来说明肾与脑的关系[3]。近年来大多数学者对于肾脑相关理论的探讨多由肾与脑血管、脑神经疾病入手，如补肾中药对延缓脑组织衰老的研究、脑卒中与肾功能损害的研究等[4-6]。所以围绝经期诸症的出现肾虚为本，精亏血虚，不能濡养脏腑，出现一系列功能紊乱征象。

延经丸是甘肃省名老中医牟惠琴教授的经验方，由生地黄、熟地黄、菟丝子、紫河车、阿胶、枸杞子、白术、巴戟天、鹿角霜、山药等药物组成，具有补肾健脾功效。前期的研究表明[7-9]延经丸能明显改善卵巢功能衰退后激素水平变化，提高女性体内雌激素的分泌，同时可以升高血清降钙素水平，达到改善围绝经期大鼠骨质疏松。说明补肾中药对HPO具有明显调控作用，具有改善女性卵巢子宫等性腺器官的功能，促进卵泡发育以及维持内分泌功能。但对HPA轴的调控作用研究较少，本研究通过实验进一步探讨延经丸能否改善肾上腺组织功能亢进，平衡激素分泌紊乱状态，达到调理女性围绝经期综合征的主要作用。

1 材料和方法

1.1 动物模型分组及给药

选用雌性SD大鼠，6月龄60只，体质量(200±20)g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(甘)2004-0006。随机分成实验组(50只)和正常组(10只)，实验组采用双侧卵巢切除造模，术后第6天开始逐只每天进行阴道脱落细胞涂片，连续观察3个动情期(15 d)，涂片呈现为动情周期紊乱、动情间期延长，为去势大鼠。造模成功后大鼠再次随机分为5组，每组10只：模型组，安定组，补佳乐组，延经丸高剂量组，延经丸低剂量组。补佳乐片(拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号：国药准字J20130009)，成人用量：每日1 mg，换算成大鼠为6.3 mg/kg，补佳乐用蒸馏水配成0.63 mg/mL溶液。地西泮，成人用量：每日2.5 mg，换算成大鼠为15.75 mg/kg，用蒸馏水配成1.575 mg/mL溶液；延经丸，成人用量：每天9 g，配成50.50 g/mL溶液；大鼠药剂量分别为25.25 g/200 g(5倍)、101 g/200 g(20倍)。各组按0.5～2 mL/200 g体质量，灌服相应药液，连续42 d(6个周期)。

1.2 标本采集

最后一次灌服药物24 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，采用眼内眦静脉丛采血法采血，每管收集1.5 mL血样于 EDTA 抗凝管中。离心(1 200 r/min)10 min后，吸取上清置-80 ℃保存。后处死，剖取肾上腺组织，固定，包埋，切片，染色。

1.3 检测指标

1.3.1 大鼠活动次数

用动物红外自主活动测试仪，记录透明饲养笼检测大鼠自由活动时间，实验选择的采样统计间隔时间为5 min，连续记录动物自主活动量，结果以1 h自主活动累积量进行表示。抑制率计算：抑制率=(正常组活动量-监测组活动量)/正常组活动量×%。

1.3.2 检测大鼠血清ACTH、CORT

应用ELISA方法在VERSA max酶标仪上测定血清内ACTH、COR 的含量，按照试剂说明书操作。

1.3.3 免疫组化SP法检测肾上腺组织的Bax、Bcl-2表达

操作程序按SP试剂盒说明书进行。分别计数肾上腺皮质组阳性细胞数。按阳性细胞所占百分比及染色强度两者结合分析判断。阳性细胞所占百分比，即阳性细胞数≤25%为(+)，25%～50%为(++),>50%为(+++)，无阳性细胞(-)；染色强度：浅黄色为(+)，棕黄色(+ +)，棕褐色为(+++)，未着色细胞为(-)。每张切片至少观察3个视野。强阳性率=+ +总数和+++表达总数之和。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠自主活动和抑制率比较

去势后大鼠烦躁，自主活动明显增加，与正常对照组、安定组、补佳乐组和延经丸高、低剂量组比较大鼠活动次数明显增加，而延经丸能明显抑制，大鼠活动减少(P<0.01)，尤其是延经丸高剂量组抑制率明显(P<0.01)。见表1、图1。

表1 各组大鼠自主活动量和抑制率比较

注：与模型组比较，**P<0.01；与正常对照组比较,△P<0.01

2.2 各组大鼠入睡率和睡眠潜伏期比较

安定组、延经丸高、低剂量组入睡率明显提高，与正常对照组、模型组之间比较都有明显差异(P<0.01)，睡眠潜伏期延经丸高剂量与模型组、正常对照组、安定组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见表2、图2。

注：与模型组比较，**P<0.01；与安定组比较，▲P<0.05；与正常对照组比较，△P<0.01

表2 各组大鼠睡眠率和睡眠潜伏期比较

2.3 各组大鼠皮质醇水平比较

各组大鼠血清皮质醇含量比较，模型组大鼠血清ACTH和CORT含量增加，尤其是血清ACTH含量增加较为显著，与正常组、补佳乐组、延经丸高、低剂量组之间比较都有明显差异(P<0.01)，而血清CORT含量与正常组、延经丸高、低剂量组之间比较有差异(P<0.01)，结果见表3、图3。

注：与模型组比较，**P<0.01

表3 各组大鼠血清皮质醇检测结果比较

2.4 各组大鼠肾上腺组织结构比较

青年组大鼠肾上腺束状带与球状带之间的界限清晰，细胞形状规则，排列有序，模型组大鼠的肾上腺束状带和球状带界限均出现明显的模糊化，可分泌CORT的束状带细胞数量明显增多，体积变大呈空泡状，可能正处于功能亢进状态。补佳乐组和延经丸高剂量组大鼠肾上腺束状带与球状带之间的界限逐渐清晰，细胞形状规则，延经丸低剂量组和模型组之间差异不大，中间空泡状组织增多，血运丰富。见图4。

图4 各组大鼠肾上腺组织结构

2.5 各组大鼠肾上腺皮质Bax和Bcl-2阳性表达的比较

见表4、图5、图6。

图6 延经丸对大鼠肾上腺皮质Bax阳性表达的影响(400×)

表4 各组大鼠肾上腺皮质Bax和Bcl-2阳性表达的比较

3 讨论

围绝经期妇女卵巢功能衰竭，雌激素水平下降，导致调节内分泌的H-P-O神经内分泌轴紊乱，机体会产生应激性保护，引起 HPA轴兴奋，刺激肾上腺分泌与释放大量糖皮质激素[10](CRH、CORT，CORT 是 HPA 轴重要激素之一可调节人体的代谢、认知功能和情绪等[11])。HPA轴功能亢进，反过来抑制HPO，抑制雌激素分泌，导致植物神经功能紊乱，出现一系列的潮热、出汗、失眠、抑郁甚至焦虑等情绪障碍，且糖皮质激素增高的程度与该病的发病程度密切相关[12]。也有研究表明[13-15]，使用雌激素可以通过抑制ACTH与CORT而起到抗抑郁的作用，进一步说明绝经期综合征(尤其是情感障碍)与围绝经期雌激素水平的低下，HPA轴功能亢进有关[16-17]。

中医学认为妇女七七之年，肾气衰，天癸竭，精血虚，气血弱，冲任不顾，脏腑功能异常，肾阴阳失调。肾主藏精为先天之本，精化气，气生精，精生血，精血同源相互滋生。绝经期肾气虚衰，肾之精血虚损，即天癸竭，伤及五脏六腑。

延经丸，主要由生地黄、熟地黄、菟丝子、紫河车、阿胶、枸杞子、白术、巴戟天、鹿角霜、山药等药物组成。以生地黄、熟地黄、鹿角霜、枸杞子、巴戟天、菟丝子、紫河车补肾壮阳，益精生髓，阴阳双补，符合肾藏精，寓水火与一脏的理论；用枸杞子、阿胶补养肝血；白术、山药健脾益气，以补后天之气，提高人体消化吸收的能力。延经丸组方从多脏腑补益调节着手，以补肾阴为主，阴阳并补，健脾益气为辅，先天与后天相辅相成，体现了中医的整体观念的思想，根据肝肾同源，精血同源的理论，肾精充足，肝血有藏，髓海得养，记忆力恢复，情绪平缓。

本研究表明延经丸可以改善卵巢功能下降后刺激引起的肾上腺功能亢进状态，大鼠自主活动减少，睡眠时间延长，与模型组比较差异有统计学意义，同时去势大鼠血清ACTH和CORT明显增高，说明存在HPA 轴亢奋状态，而延经丸和补佳乐组能抑制糖皮质激素的水平,与模型组比较差异有统计学意义。通过组织病理学表现分析去势大鼠肾上腺束状带和球状带界限不清晰,束状带细胞数量明显增多,呈空泡状,表面以上组织均存在明显损伤，肾上腺皮质层中Bax强表达，bcl-2弱表达，延经丸和补佳乐组能抑制肾上腺皮质层Bax的表达，提高bcl-2的表达，各组之间比较有差异。进一步说明延经丸能够下调异常增高的糖皮质激素，大大改善平衡和改善机体应激状态。机体产生应激性保护，引起HPA 轴亢奋，而兴奋的 HPA 轴抑制HPO轴的功能，雌激素和延经丸都可以抑制亢奋的HPA轴，尤其以延经丸高剂量组作用最显著。

当 HPA 轴长期处于亢进状态，可导致神经内分泌异常和情感异常行为的发生[18]。所以针对围绝经期出现肾上腺亢进引起的烦躁易怒，以及情感障碍的患者，在中医治疗上，可以通过“补益肝肾”的治疗原则，来调节HPO轴与HPA轴之间的功能紊乱，从而缓解围绝经期出现一系列综合征。