贵州小麦品种(系)中慢锈基因Lr34/Yr18的分子检测

杨雪敏，任明见，李鲁华，徐如宏

(1.贵州大学农学院，贵阳 550025； 2.国家小麦改良中心贵州分中心，贵阳 550025)

我国是小麦生产大国之一，每年小麦种植面积在2 400万hm2左右[1]。在我国大部分地区都会发生小麦锈病，据全国农业技术推广服务中心统计[2]，2019年小麦条锈病在江汉平原、汉水流域、西南和西北部分麦区中等发生，局部偏重，全国发生面积200万hm2。贵州由于其独特的气候和地理条件，也非常适合小麦锈菌的流行和危害，导致小麦锈病连年发生[3]。同时，由于条锈菌致病性变异频繁，2019年春季西南麦区条锈菌新致病类群贵农22不断上升为优势种群，小麦品种抗性丧失[2]。因此，目前对小麦生产品种抗锈性提出了更高要求。研究表明，培育、推广抗病小麦品种一直是最为经济有效且绿色环保的防控措施[4]。特别是培育慢病性品种是培育抗性持久，减少病害突然爆发、大面积流行隐患的重要手段[5]。近年来，慢锈病抗性基因的研究和利用越来越受重视，培育慢锈品种成为国际小麦抗病育种的主流方向[6]。例如，国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)育成一大批慢锈品种，并在世界各地推广，携带Lr34/Yr18的小麦品种在印度和巴基斯坦等发展中国家广泛种植[7]；在澳大利亚也已将慢锈基因Lr34/Yr18及其紧密连锁的分子标记csLV 34 成功应用于小麦育种[6]。

小麦慢条锈病(Pucciniastriiformisf. sp. tritici)这一概念由Zadoks[8]首次提出，其发现有些含有主效基因的小麦品种在抗性被条锈菌克服后，仍然具有微弱抗性。小麦的慢锈病基因中，Lr34/Yr18基因较早在小麦生产中得到了应用[9]。Dyck等[10]最早报道了Yr18和Lr34的抗性水平，并将其定位于7 D上；后来许多学者利用QTL分析技术将该位点定位在小麦7 DS染色体上[11-15]。Lr34最初可能来源于巴西的农家种Alfredo Chaves或乌拉圭的农家种选系Americano 44 D[12]。Krattinger[16]利用图位克隆法获得了Lr34基因的全长序列，并证实了Yr18/Lr34这2种病害由同一基因位点所控制。Lr34/Yr18基因具有良好慢锈性，一般在苗期呈感病而在成株期表现抗性，它与秆锈(Sr34) 、叶锈(Lr34) 、白粉(Pm38)等多个抗性基因连锁[12,17]，属“一因多效”的优良基因[18,19]。也有研究发现，Lr34/Yr18基因位点与叶尖坏死基因Ltn1、抗小麦黄矮病基因Btv1紧密连锁[19,20]。同时，Hua Chen等研究表明，含有Lr34/Yr18基因的叶锈和条锈的侵染率明显低于不含有Lr34/Yr18的品种，其结合3～4个微效基因可以在环境中提高叶锈和条锈的抗性[22]。

为了方便开展Lr34/Yr18基因的分子辅助选择，Lagudah[22]和Yuan等[23]以EST得到的克隆作为探针进行RFLP分析，找到了一个能清晰区分含有和不含Lr34/Yr18的RFLP标记，后开发了功能标记csLV 34。许多学者利用csLV 34标记鉴别小麦品种中是否携带Lr34/Yr18基因，证明该标记是一个重复性好、准确率高的分子标记，可用于小麦Lr34/Yr18基因的鉴定与选择[6,24-30]。贵州处于云贵高原，锈病常年流行，在小麦品种中导入Yr18/Lr34基因有利于提高叶锈和条锈抗性，对于兼抗和持久抗性品种的选育也具有重要意义。但贵州小麦中开展慢锈性研究和慢锈抗病品种选育的报道较少，仅见梁传静等[31]对贵州种植的115个小麦品种资源进行慢锈性品种鉴定，初步筛选出26个可能具有慢锈抗性品种，但这些材料是否含有Lr34/Yr18基因没有进行进一步鉴定。本研究利用STS标记csLV 34对258份贵州小麦品种(系) 进行分子检测，以了解慢锈病基因Lr34/Yr18在这些小麦品种(系)中的分布，同时筛选含有慢锈基因的优良小麦种质资源，为贵州慢锈抗性小麦新品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试小麦材料258份，由国家小麦改良中心贵州分中心收集和保存，详见表1。

续表1：

1.2 试验方法

1.2.1基因组DNA的提取

每份材料随机取10粒种子发芽, 采用植物基因组DNA提取试剂盒(购自天根公司www.tiangen.com)的方法提取DNA。分光光度计检测其浓度，并稀释到50 ng·L-1作为模板DNA备用。

1.2.2STS标记检测

根据Lagudah等[32]开发的特异性STS标记csLV 34检测Lr34/Yr18基因，上游引物序列为5′-GTTGGTTAAGACTGGTGATGG-3′，下游引物序列为5′-TGCTTGCTATTGCTGAATAGT-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。参照Lagudah等[32]的方法进行PCR扩增，反应体系为20μL，总体积中含有20 mmol·L-1Tris-HCl(pH=8.4)、20 mmol·L-1KCl、0.2 mmol·L-1dNTPs、1.5 mmol·L-1MgCl2，每条引物10 pmol，TaqDNA 聚合酶1 U，模板DNA 100 ng。PCR反应体系为94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。

1.2.3毛细管电泳检测

PCR扩增产物使用毛细管电泳系统(美国AATI, Fragment AnalyzerTM)进行检测。使用的905-33-DNA-0～500 bp.mthds试剂盒购于Analogic Tech(www.aati-us.com)。使用24μL体系：2μL PCR扩增物+22μL Buffer TE。检测程序：预运行电压和时间为6 kV，30 s；Marker进样电压和时间为5 kV，10 s；样品进样电压和时间分别为5 kV和10 s；分离时电压和时间为6 kV和45 min。

图1 标记csLV 34对贵农10-3-16-7扩增产物的毛细管电泳谱带图

图2 标记csLV 34对贵农31扩增产物的毛细管电泳谱带图

图3 标记csLV 34对贵农08-9扩增产物的毛细管电泳谱带图

2 结果与分析

2.1 STS标记csLV 34的鉴定结果

在本研究中，采用毛细管电泳系统对STS标

记csLV 34的扩增产物进行了检测。根据Lagudah等[32]的研究，STS标记csLV 34主要扩增得到2个DNA片段，其中只有扩增出150 bp片段的材料可能含有Lr34/Yr18，而扩增出229 bp或其它片段的材料不含Lr34/Yr18。从本研究检测结果看，毛细管电泳谱带清晰易读，可根据扩增片段分子量直接判断目标片段有无。STS标记csLV 34在258份材料中主要扩增出150 bp(图1)、229 bp(图2)、236 bp(图3)等特异片段，与前人研究结果基本一致。Kolmer等研究发现，STS标记csLV 34的扩增产物中除了229 bp片段以外，还有一个比229 bp约大50 bp的片段，但该片段与Lr34/Yr18无关[33]。本研究中也发现了相似扩增片段，其大小为266 bp，与目标片段229 bp相差37 bp(见图2)。

2.2 小麦品种(系)中Lr34/Yr18基因的检测结果

利用STS标记csLV 34对258份小麦材料进行检测，结果见表1。有5个小麦材料检测到150 bp的特异片段，分别是张10选42，紫R 3-2-2-3，黔09197，贵农10-3-16-7和贵农19，表明这5个小麦材料可能含有Lr34/Yr18基因，占供试材料的1.9%。其余材料中，扩增片段大小为229 bp的有61份，占23.6%；236 bp的有105份，占40.7%；还有167 bp、 263 bp及其它不同带型的占33.8%，这些材料中都没检测到150 bp的特异片段，表明其可能不含Lr34/Yr18基因。

3 讨 论

有研究报道，中国小麦品种(系)中含有Lr34/Yr18基因频率极低，主要原因是过去在品种选育中过分强调高抗或免疫的主效基因的选择，忽视了慢病基因的利用[6,34]。国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)加大慢病性基因Yr18/Lr34的利用研究，在其小麦品种中慢锈基因Yr18/Lr34分布频率较高，达21.7%[34]。本研究中，258份小麦材料中仅检测到5份含有Lr34/Yr18基因，占供试材料的1.9%，相对于杨文雄等[6]的研究，本研究中Lr34/Yr18基因分布频率较低，而与张玉薇等[35]的研究结果相近，说明在贵州小麦品种(系)中含有Lr34/Yr18基因的材料较少，在过去的小麦育种中对慢锈抗性基因的利用研究重视不够，今后应加大Lr34/Yr18等慢锈抗性基因的利用，有针对性地培育持久抗病品种。同时，据杨文雄等[6]的研究表明，中国小麦品种(系)中农家品种携带Lr34/Yr18基因的比例较高，达到85.1%，因而在贵州小麦地方品种和农家品种中也可能含有较多的慢锈病抗源，在以后应加强地方品种和农家品种的收集、鉴定和利用研究，扩大慢锈病基因的种质来源。

贵州锈病常年流行，开展慢锈病育种和品种合理布局对控制锈病流行和生理小种变化具有重要意义。但是在对Lr34/Yr18基因的应用过程中，Kolmer等[33]认为，Lr34/Yr18基因的抗性主要在成株期表达，容易被其他主效基因的影响所掩盖，而且受不同品种背景和其他基因的影响，会导致鉴定的不准确。所以在实际工作中，开展小麦慢锈病抗性鉴定，需要在室内条件下进行分小种接种测定才能取得准确结果，这为开展小麦慢锈病育种和品种选育增加了难度。另外，在进行大群体的分子辅助选择过程中，由于不能准确鉴定慢锈抗性植株会降低育种的选择效率。已有研究结果已验证了STS标记csLV 34的有效性，则可在小麦慢锈抗病育种中利用此标记开展分子辅助选择，从而提高育种选择效率。

本研究对258份小麦品种(系)进行检测，发现5份可能含有Lr34/Yr18基因，分别是张10选42，紫R 3-2-2-3，黔09197，贵农10-3-16-7和贵农19。在彭昕等[36]的研究中，贵农19并没有检测到csLV 34标记特异片段，可能是和本研究用到的材料名称相同但遗传组成不同。在本研究中贵农19-1品系也没有检测到，说明在相同原始亲本的后代品系中可能会出现不同类型，不同来源品系可能含有不同的抗性基因。对于筛选出的这5个可能含有Lr34/Yr18基因的小麦品系，可以直接作为慢锈病抗性育种和遗传改良的亲本材料应用于小麦育种中，也可与更多抗病基因聚合选育兼抗和持久抗性品种，从而提高贵州小麦抗病育种的水平和促进小麦生产的可持续发展。