27种木本花卉抗寒与抗旱性评价

徐 放，张卫华，潘 文，杨会肖，杨晓慧，廖焕琴，徐 斌，朱报著，王裕霞

（广东省森林培育与保护利用重点试验室/广东省林业科学研究院，广东 广州 510520）

【研究意义】我国木本花卉资源丰富、应用广泛，具有较大的市场潜力，仅广东省木本花卉年产值就超过9亿元。但不同木本花卉品种栽培条件差异较大，且近年来极端气候发生频率增加［1］，盲目引种栽培可能会因为气候因素造成较大损失［2-3］。【前人研究进展】近年来，对抗寒性和抗旱性的研究逐步深入，基于生理指标对抗逆能力进行评定的研究体系已日趋成熟［4-5］，相对电导率（EC）和相对含水量（RWC）等已经被广泛应用于各物种的抗逆研究中，取得了很好的效果，Deans等［6］对橡树进行相对电导率的检测，评价了在不同寒害条件下植株的损伤情况；Su等［7］和Sedaghat等［8］分别在黑麦草和冬小麦中利用相对含水量的检测对不同家系的抗寒水平进行了评定。以往研究主要利用隶属函数法评定抗逆性的强弱，如苏李维等［9］利用多个生理指标的隶属函数法对葡萄的抗寒能力进行了排序。但相关研究方法利用主成分分析减少生理表型的数据进行后续分析时，部分测定数据无法发挥最大的统计效力，也无法利用由逆境处理时间或处理方式的变化而引起的生理数据的动态变化。将k-mean等统计方法引入抗逆研究中，可以为不同物种或品种抗逆能力的聚类提供了更为精准的分类手段，可以获得更为直观的抗逆性聚类，而且可以更充分利用测量得到的动态变化的生理数据［10］。在综合评价的研究中，TOPSIS方法被广泛应用于工程［11］、数学［12］、医疗［13］等多个领域，引入抗逆行评价中可以丰富相关的研究方法。【本研究切入点】到目前为止，我国南方地区主要栽培的木本花卉物种对低温和干旱的抗性研究尚无报道，急需相关研究指导后续的引种和栽培。【拟解决的关键问题】为了比较和评价不同木本花卉植物的抗寒和抗旱能力，同时对不同物种的抗性进行准确排序和聚类，本研究选用27个木本花卉物种为研究材料，分析低温和干旱胁迫比较不同逆境处理下的生理指标差异，首次在抗逆性研究中采用k-means方法对抗逆能力进行聚类并利用TOPSIS方法进行抗性排序，以期为木本花卉的引种和栽培应用提供依据，也为抗逆性的研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用27个物种的生长均一的种子苗作为试验材料，包括黄花风铃木（Handroanthus chrysanthus）、蓝花风铃木（Tabebuia pentaphylla）、金花风铃木（T.rosea）、火焰木（Spathodea campanulata）、蓝花楹（Grafton jacaranda）、本地木棉（Bombax malabaricum）、美丽异木棉（Ceiba speciosa）、广宁红花油茶（Camellia semiserrata）、杜鹃红山茶（C.azalea）、小叶紫薇（Lagerstroemia indica）、大叶紫薇（L.speciosa）、黄槐（Cassia surattensis）、无忧木（Saracadives Pierre）、宫粉羊蹄甲（Bauhinia variegata）、红花羊蹄甲（B.blakeana）、铁刀木（Cassia siamea）、腊肠树（C.f istula）、仪花（Lysidice rhodostegia）、凤凰木（Delonix regia）、穗花棋盘脚（Barringtonia racemosa）、美花红千层（Callistemon citrinus）、深山含笑（Michelia maudiae）、樱花（Prunus serrulata）、红桦银桦（Grevillea banksii）、国庆花（Koelreuteria bipinnata）、澳洲火焰木（Brachychiton acerifolius）、红花荷（Rhodoleia championii）。选择地径3.5 mm以上、株高20 cm以上、真叶展开8片以上的幼苗进行试验。

1.2 试验方法

1.2.1 抗寒性试验 低温胁迫于2019年3月在华南农业大学人工气候箱（HP1000GS型）内进行，光照强度为1 200 lx，光照时间为12 h，相对湿度保持在75%～85%。试验苗木表面灰尘洗净后放入人工气候箱内，以常温（25 ℃）为对照，设9±1、6±1、3±1、0±1、-3（±1）℃等5个温度梯度，以3 ℃/d降温，当温度降至某一设定温度时，保持24 h，选择第2～6展开叶进行测定，3次重复，每个重复1个单株。取样时间均为上午8：00，采样后继续降温（表1）。

表1 抗寒试验人工气候室降温程序Table 1 Cooling procedure of cold resistance test in artificial climate chamber

1.2.2 抗旱性试验 采用PEG水分胁迫模拟干旱处理，每个树种选取3株生长一致的健壮苗木，3次重复，以单株为1个重复。试验用1/2 Hoagland营养液和聚乙二醇6000（Polyethylene glycol 6000，PEG-6000）配制以下渗透势的溶液：0 MPa（CK），－0.3 MPa（PEG-6000含量50 g/L），－0.5 MPa（PEG-6000含量150 g/L），－2.0 MPa（PEG-6000含量300 g/L）。苗木先在1/2 Hoagland营养液中过渡48 h，洗净后放入不同渗透势的PEG溶液中，进行轻胁迫、中胁迫、强胁迫，每种胁迫分别处理12、24、36 h，以不加PEG的1/2 Hoagland营养液作对照。各处理均在室温下进行，室内温度为26 ℃左右，相对湿度为75%～85%。不同树种相同指标均选择上午8：00同时取样进行测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 电导率 取幼苗自上而下第2～6片展开叶，将叶片先用自来水轻轻冲洗除去表面的污物，然后用去离子水冲洗2遍，再用滤纸轻轻吸干叶片表面的水分，避开主叶脉，用打孔器打取3个直径为0.8 cm的圆片，用去离子水冲洗3次，放入内有20 mL去离子水的三角瓶中，室温放置15 h，然后用电导仪（DDS-307型）在室温下测定溶液的的电导率值（R），之后封住三角瓶口，在富华仪器有限公司生产的420型三用水箱中沸水浴30 min，以将组织全部杀死，冷却至室温后在同样的条件下测定各瓶溶液的电导率值 （R1），以叶片杀死前的电导率占杀死后电导率的百分数表示膜的相对透性，计算相对电导率：

相对电导率（EC）＝R/R1×100

1.3.2 相对含水量（RWC） 采样称取鲜叶质量后用蒸馏水浸泡24 h，然后称饱和鲜质量，最后在105 ℃下烘8 h称干质量，计算RWC：

1.4 数据分析

试验数据利用R语言［14］agricolae程序包［15］和自编程序完成低温处理下不同物种的生理指标进行单因素方差分析，对干旱处理的生理指标进行双因素方差分析，并利用Duncan多重极差检验法进行多重比较。将不同物种在5个温度下的RWC和EC指标值，使用NbClust程序包［16］，利用k-means方法分别进行聚类分析，并分别对比RWC和EC聚类结果的差异，提取出聚类有差异的物种进行第二次k-means聚类分析。以不同干旱胁迫程度和不同时间的9个RWC和EC指标值分别对各物种进行聚类，分析过程与低温试验数据分析相同。选择0℃时的RWC和EC作为抗寒能力排序的指标，选择强干旱胁迫下处理36 h的RWC和EC作为抗旱能力排序的指标，利用TOPSIS方法对各物种的抗寒和抗旱能力进行排序，首先利用R语言scale（）命令对不同指标进行归一化处理，利用以下公式进行排序指标计算：

Ui=（ECi-ECMin）2+（RWCi-RWCMax）2

式中，ECi和RWCi分别为归一化后各组数据的值，ECmin和RWCmax分别为归一化处理后各数据的最小值和最大值，因EC与抗性呈负相关，RWC与抗性呈正相关，因此选择ECmin和RWCmax作为标准。

2 结果与分析

2.1 低温和干旱对木本花卉生理指标的影响

基于试验测定，各物种不同逆境处理与对照条件下的生理指标见表2、表3和表4，对照不同树种RWC在79.1%～109.2%之间，随着处理温度的降低，低温处理各RWC指标逐步下降，其中大叶紫薇在-3 ℃处理后RWC值降至12.4%，为所有处理的最低值；对照EC在13.0%～39.8%之间，低温处理中该指标随着温度的降低而逐渐升高，以红花荷在-3 ℃处理后EC值最高，达到85.4%。干旱处理RWC和EC与低温处理呈相同的变化趋势，其中仪花在强干旱胁迫36 h后RWC值在所有检测样本中最低，降低至16.8%；所有样本中，腊肠树在干旱胁迫36 h后EC值最高，达到87.0%。

2.2 抗寒能力评价

由表3、图1可知，基于27个树种的RWC和EC指标，计算k-means聚类数均为2类，即抗寒和不抗寒两个类群，第一次聚类时，小叶紫薇、大叶紫薇、黄槐、无忧树、红花羊蹄甲、仪花、红花银桦、国庆花8个物种在RWC和EC聚类中存在差异（图1A、B），因此对上述8个物种进行第二次聚类，RWC和EC重新聚类结果8个物种被分为两类且结果相同（图1C、D）。在两次聚类中，聚类1各物种在降温至6℃时平均EC变化曲线显示其电导率有较大的提升，相对含水量明显下降，而聚类2在降温至0℃前电导率变化幅度较小，降至0℃后电导率才有显著提升，相对含水量也是在温度降至0℃之后才出现明显下降。因此，认为聚类1中的14个物种为不抗寒物种，聚类2中的13个物种为抗寒物种。

表2 27个物种低温胁迫生理指标变化情况Table 2 Changes in physiological indicators of 27 species under low-temperature stress

表4 27个物种抗寒聚类情况Table 4 Clustering of cold resistance of 27 species

图1 27个物种低温胁迫下生理指标变化曲线与抗寒性聚类情况Fig.1 Physiological index change curve wder low-tempter ture stress and cold resistance ability clustering of 27 species

2.3 抗旱能力评价

由表5可知，基于干旱试验中各物种的RWC和EC变化情况，利用Kmeans聚类结果显示两指标的最优聚类数均为2，且各聚类内包含的物种完全相同。由图2可知，不同程度干旱胁迫下，聚类2物种的RWC和EC随着时间的变化均显示出更为明显的变化，而聚类1的两指标随时间变化相对稳定，且聚类2各物种的平均电导率高于聚类1、相对含水量低于聚类1。表明聚类1中17个物种为抗旱物种，聚类2中10个物种为不抗旱物种。

表5 27个物种抗旱聚类情况Table 5 Drought resistance ability clustering of 27 species

图2 27个物种干旱胁迫下生理指标变化曲线与抗旱能力聚类情况Fig.2 Physiological index change curve under drought stress and drought resistance clustering of 27 species

2.4 抗寒和抗旱能力综合评定

对RWC和EC表型进行归一化处理后求得各物种的U值，其中抗寒U值最大的物种为黄花风铃木（21.75），最小为杜鹃红山茶（0），即杜鹃红山茶抗寒能力最强，黄花风铃木抗寒能力最弱；抗旱U值最大的物种为腊肠树（30.50），最小为铁刀木（0），即铁刀木抗旱能力最强，腊肠树抗旱能力最弱。各物种抗寒能力与抗旱能力U值和排序见表6。基于各物种抗寒与抗旱能力的U值结果，以抗寒U值为横坐标，抗旱U值为纵坐标，对所有物种的抗逆性进行综合评定（图3），可见其物种抗逆能力的分布情况。评价结果显示山茶科两个物种、千屈菜科两个物种均呈现对低温和干旱较好的抗性，有较好的向寒冷和干旱地区推广的潜力。

表6 27个物种抗寒和抗旱能力排名Table 6 Ranking of cold and drought resistance ability of 27 species

图3 27个物种抗寒和抗旱能力综合评定Fig.3 Comprehensive evaluation of cold and drought resistance of 27 species

3 讨论

植物叶片的电导率和相对含水量等生理指标是反映植物胁迫抗性的最直观的指标［17-19］。研究表明，大多数常绿树种难以长时间耐受0 ℃以下的低温胁迫，短时低温胁迫可恢复生长［20］。本研究中，温度降低至6 ℃时，不抗寒物种的生理指标变化不明显，并未出现较为严重的伤害；当温度降至3 ℃时，抗寒物种与不抗寒物种的生理指标开始产生明显差异；所有物种在温度降至0 ℃以下时生理指标产生了明显变化。因此，在种植非抗寒物种时应注意避免6 ℃以下的低温胁迫，种植抗寒物种时应避免冰点以下胁迫，防止细胞液结冰造成细胞组织结构的破坏，进而形成不可逆的伤害，育苗阶段可通过改善农艺设施增加保温装置的方法完成。

干旱是植物面临的常见胁迫，植物大量失水后，引起大部分生理代谢的紊乱，短时间内即可造成严重的不可逆伤害，耿云红［21］的研究表明植物叶片电解质损失超过50%后，即使恢复水分供应，植物也将会受到永久损伤而无法完全恢复。本研究10个不抗旱物种的生理指标显示在中度和重度干旱胁迫条件下，24～36 h阶段内，EC平均曲线快速升高，36 h后相对电导率均超过50%，RWC的平均变化曲线基本维持不变，说明这些物种在受到干旱胁迫24 h后已受到较严重的不可逆伤害，而抗旱树种在干旱胁迫24 h后生理指标变化趋缓，表明各树种对胁迫产生了一定程度的适应性。因此，在进行木本花卉物种的苗期培育时，应使用完善的培育设施如温室、喷灌或滴灌等，以保证充足的水分供应，不可使胁迫超过24 h，以免造成种苗的严重的损失。

k-means聚类方法是一种迭代求解的聚类分析算法［22］，已被利用在各个研究领域的聚类问题中［23-25］。本研究中引入k-means统计方法对动态变化的生理指标进行聚类用以推断不同物种抵抗逆境的能力，取得了较好的效果，可以明显看出对寒冷和干旱抗性差异明显的物种在应对胁迫中产生了不同的生理反应过程，结合TOPSIS方法对各物种的抗寒和抗旱能力进行综合排序，可以明确不同物种的抗逆程度，对引种和栽培提供了有力的指导。

4 结论

本研究结果表明，在不同的低温胁迫和干旱胁迫下，27个物种的生理指标呈现出显著的差异，叶片电导率随着胁迫程度的加重和胁迫时间的增加而增加，相对电导率则呈现相反的变化。根据k-means聚类和TOPSIS综合比较法分析表明，13个物种为抗寒物种，其中杜鹃红山茶抗寒能力最强；17个物种为抗旱物种，其中铁刀木抗旱能力最强。山茶科和千屈菜科物种呈现出较强的对低温和干旱的综合抗性；紫薇科和豆科类似，科内的物种抗逆性差异较大；木棉科树种抗旱能力较强，抗寒能力较差。