高尔基体整合膜蛋白4在人头颈癌中的表达及临床意义

肖国岫 郑义彩 吴 情 曾飞跃 徐 斌

头颈癌是指起源于鼻、口腔、咽喉等部位上皮恶性肿瘤，其中90%以上为鳞癌，即头颈鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）[1]。据相关文献报道，2012年HNC患者约占恶性肿瘤患者的4.9%，死亡人数约占恶性肿瘤死亡人数的4.6%，且其发病率和死亡率具有逐年上升趋势[2]。基于头颈部解剖结构的复杂性和暴露患者器官功能的重要性，HNC治疗较为复杂，而探究HNC的发病机制对提供新的治疗思路和方法具有重要意义。高尔基体整合膜蛋白4（golgi integral membrane protein 4，GOLIM4）是高尔基体转运复合物的重要组成部分，参与高尔基体蛋白的转运过程[3]。有部分研究报道高尔基体相关蛋白可能参与了恶性肿瘤的生物学过程，但目前相关研究较少[4]。本次研究以我院收治的72例HNC患者为研究对象，探究GOLIM4在HNC中的表达及与临床病理关系，以期为临床诊疗提供一定参考依据。

资料和方法

1.组织标本及临床资料

选取2015年1月～2018年6月我院收治的72例HNSCC患者，包括58例口腔癌、12例口咽癌和2例喉癌，采集患者鳞癌组织作为HNSCC组。患者纳入标准：①HNSCC患者符合《头颈部肿瘤综合治疗专家共识》[5]中的诊断标准；②取鳞癌组织前患者未经过放化疗；③年龄20岁及以上；④患者知情并签署知情同意书。排除标准：①病理资料不完整或无法随访；②随访过程中遵照医嘱治疗；③具有免疫治疗或放化疗史。另选对应的头颈部正常组织（病理活检或外科手术时取得）37例作为对照组。本次研究经我院医学伦理委员会通过。收集患者临床资料，包括患者性别、年龄、肿瘤直径、病理分级、临床分期及淋巴结是否转移等。临床分期和分化程度参考第8版AJCC头颈癌分期指南[6]分为T1-T4期。采用影像学、颈部触诊、纤维喉镜等检查结果或手术确定患者肿瘤是否转移。随访5年，记录患者生存情况。

2.免疫组化

组织标本经甲醛固定、石蜡包埋、切片后，按照试剂盒说明书采用两组染色法进行操作：烤片、脱蜡、抗原修复、消除内源性过氧化物酶活性、血清封闭，随后加入一抗（4℃过夜）、二抗（37℃ 2h），DAB显色，待细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。

3.RT-PCR检测GOLIM4 mRNA表达

分离提取的新鲜组织标本，加入Trizol试剂提取总RNA，测定浓度后取5μl逆转录为cDNA，以cDNA为模板在PCR仪（LightCycler 480型）上进行定量检测，GOLIM4引物：上游，5'-AAACTCTATGCT CCCACCC-3'，下游 5'-GCTGCTCTTTCCACTCCC-3'，内参GAPDH引物：上游5'-TGACTTCAACAGCGAC ACCCA-3'，下游:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAA A-3'。计算待测基因相比正常组织中表达改变的倍数，结果以2-△△Ct表示为GOLIM4mRNA的相对表达量。

4.Western blot检测GOLIM4蛋白表达

获取组织细胞裂解物，采用BCA检测蛋白质浓度，随后采用SDS-PAGE电泳，随后进行转膜，加一抗（4℃过夜）、二抗（室温 2h）、显影，采用 Image lab拍照，并进行蛋白条带灰度分析。

5.统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件包分析数据，符合正态分布计量资料以（χ±S）表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分率“%”表示，组间比较采用χ2检验。记P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.两组GOLIM4 mRNA及蛋白表达情况比较

HNSCC组中GOLIM4mRNA及蛋白表达量明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。免疫组化检测结果显示，GOLIM4主要表达在胞浆中，且在对照组中低表达，在HNSCC组呈现高表达，见图1。

表1 2组GOLIM4 mRNA及蛋白表达情况比较（χ±S）

图1 免疫组化检测GOLIM4表达情况

2.GOLIM4mRNA表达与头颈癌患者临床分期关系

RT-PCR检测结果显示，GOLIM4mRNA表达与病理分级、临床分期、淋巴结转移有关，且病理分级T3-T4级患者GOLIM4mRNA表达水平高于T1-T2级，临床分期Ⅲ-Ⅳ期GOLIM4mRNA表达水平高于Ⅰ-Ⅱ期，淋巴结转移患者GOLIM4mRNA表达水平高于无淋巴结转移患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

3.GOLIM4表达与头颈癌患者病理分级关系

Western blot检测结果显示，GOLIM4蛋白表达与病理分级、临床分期、淋巴结转移有关，且病理分级T3-T4级患者GOLIM4蛋白表达水平高于T1-T2级，临床分期Ⅲ-Ⅳ期GOLIM4蛋白表达水平高于Ⅰ-Ⅱ期，淋巴结转移患者GOLIM4蛋白表达水平高于无淋巴结转移患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表 3。

4.GOLIM4表达与头颈癌患者预后关系

72例HNSCC患者的5年生存率为47.2%（34/72），其中生存组GOLIM4mRNA及蛋白表达水平低于死亡组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表2 GOLIM4 mRNA表达与头颈癌患者临床分期关系（χ±S）

表3 GOLIM4蛋白表达与头颈癌患者病理分级关系（χ±S）

表4 预后不同患者GOLIM4 mRNA及蛋白表达情况比较（χ±S）

讨 论

头颈部恶性肿瘤的绝大部位病理表现为鳞状细胞癌，由于头颈部复杂的解剖结构和转移途径，有70%左右患者在确诊时已为晚期[7]。而HNSCC癌细胞浸润程度深、病变范围较大，行手术切除区域较大，患者预后及生存率均不够理想[8]。因此探究HNSCC的发病机制对提供新的治疗思路和方法具有重要意义。肿瘤的发生发展过程涉及多种复杂物质能量代谢变化及细胞信号通路传导，高尔基体是细胞中蛋白质的重要加工场所，参与了细胞分化和多种信号通路传导过程。目前已经发现部分高尔基体相关蛋白如高尔基体蛋白73（GP73）[9]、高尔基体基质蛋白130（GM130）[10]等与肿瘤生物学行为密切相关。有学者推测高尔基体可能通过调节机体蛋白质加工和物质能量代谢从而参与了肿瘤细胞增殖和凋亡过程[11]。还有学者发现高尔基体功能障碍可影响肿瘤的形成，其原因可能来自于内质网-高尔基体的相互作用[12]，但目前具体机制尚不明确。本次通过在分子生物学水平对高尔基体相关蛋白GOLIM4表达进行研究，以期为HNSCC发病机制研究和临床诊疗提供参考依据。

GOLIM4是一种分子量为130kDa的Ⅱ型高尔基体蛋白，整合到顺式/内侧高尔基体中并在高尔基体和核体间循环，对高尔基体具有修饰功能[13]。目前关于GOLIM4表达在肿瘤中研究较少。本次研究发现，HNSCC组中GOLIM4 mRNA及蛋白表达量明显高于对照组，提示GOLIM4在HNSCC中表达水平明显上调，推测原因可能与GOLIM4表达能影响细胞中Ca+浓度平衡有关。细胞Ca+浓度平衡对调节肿瘤细胞增殖、迁移、分化、凋亡等多种信号通路具有调节作用，而与GOLIM4结合的内质网基质相互作用分子蛋白（STIM1）是钙库操作性钙内流（SOCE）通路的组成蛋白，在维持Ca+稳态中起到关键作用[14]。在有学者采用慢病毒感染干扰下咽鳞癌细胞中GOLIM4表达后发现细胞增殖活性受到抑制，且STIM1水平也明显降低，推测GOLIM4可能通过影响STIM1表达调节Ca+稳态，从而影响肿瘤细胞的增殖过程[15]。RT-PCR及Western blot检测结果显示，GOLIM4 mRNA及蛋白表达与临床分期、病理分级和肿瘤转移有关，提示GOLIM4参与了HNSCC进展过程。已有研究发现GOLIM4过表达可激活结肠癌患者体内的Wnt/β-catenin信号通路参与了结肠癌细胞增殖和肿瘤组织的生长[16]，还有研究发现GOLIM4可影响高尔基体中磷脂酰肌醇-4-磷酸（PIP）活性，而PIP可调节肿瘤细胞的粘附力而影响肿瘤细胞的转移[17]，因此推测本研究中GOLIM4可能也通过调节Wnt/β-catenin信号通路或PIP活性影响HNSCC细胞的增殖和转移，从而影响HNSCC的进展，但具体情况有待进一步研究。随访5年，生存组GOLIM4 mRNA及蛋白表达水平低于死亡组，提示GOLIM4在预后较好的HNSCC患者中表达水平较低，能有助于HNSCC的临床病情评估和预后预测。

综上所述，GOLIM4在HNSCC中表达上调，且与患者临床病理相关，对患者病情评估和预后预测具有一定的临床价值，其中作用机制有待进一步研究和论证，而GOLIM4可为HNSCC临床治疗提供新的靶点和思路。