木质纤维降解复合菌剂促进堆肥腐熟研究①

何宙阳，徐 谞，刘 超，刘红军，李 荣，沈 标，沈其荣

(江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室/江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心/国家有机肥类肥料工程技术研究中心/南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095)

我国是农业大国，农作物收获后产生了大量秸秆资源[1]，年均产量约占世界总产量的 30%[2]，并且含有大量有机质和丰富的氮、磷、钾等营养元素[3]，是一类重要的能直接利用的可再生生物资源。但秸秆的不科学利用，对环境造成了巨大压力[4]。当前，秸秆资源的利用方式有用作动物饲料[5]和食用菌栽培等原料[6]，但利用量有限；直接还田和养畜过腹还田技术在我国北方和降雨量少的区域，限制了下茬作物的高效栽培[7]；秸秆发电和生产工业原料等工序复杂、成本较高，甚至具有形成二次环境污染风险[8-9]。另外，改革开放40 多年来，我国的畜牧业已经完全进入规模化养殖阶段[10]。据统计，中国高度集约化养殖业每年产生的畜禽粪便(鲜重)类养殖废弃物高达40 亿t[11]。因此，如何高效处理这两类废弃物，成为当前迫切需要解决的重要命题。

好氧发酵是废弃秸秆和畜禽粪便无害化处理和资源化利用的重要方式[12-13]，更为重要的是，畜禽粪污普遍氮含量较高，其和秸秆采用最优配比混合能够有效驱动堆肥进行[14]。但畜禽粪污和秸秆成分复杂，依靠单一菌种或简单组合的复合菌群，存在降解不充分且效率低等难题。另外，高效复合菌群菌种多样性的特点使其能够适应各种生境[15]，不同的微生物种群在堆肥过程的不同阶段对不同有机物降解起关键驱动作用[16]。因此，开发木质纤维高效降解微生物复合菌群，并研究其实际驱动堆肥的效果是目前研究的重点。

本研究首先测定复合微生物菌群在降解木质纤维过程中的分泌酶的活性并评估了室内对秸秆粉的降解效果，随后分别以秸秆和猪粪秸秆混合物为原料，研究了接种复合微生物菌群，相比于接种单一菌株和不接种外源菌株的堆肥效率，探究了微生物菌剂的添加对堆肥腐熟效率的影响，以期为秸秆和畜禽粪污的资源化利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与时间地点

高效木质纤维降解菌均由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室提供，复合菌剂由等浓度的米黑根毛霉菌NJAU-F4-5、芽孢杆菌NJAUN20 和芽孢杆菌NJAU-N30(V︰V︰V= 1︰1︰1)组成。试验用的玉米秸秆由四川乐山玉米种植基地提供，猪粪由当地养猪场提供，其基本理化性质见表1。试验时间为2018 年8 月25 日—2018 年10 月5 日，在四川省乐山市奥甘霖生物科技有限公司某堆肥车间进行。

表1 堆肥原料基本理化性质Table 1 Basic properties of main composting materials

1.2 试验设计

1.2.1 复合菌剂制备 将真菌接种至PDA 液体培养基，50 ℃、170 r/min 条件下培养2 d；将细菌接种至LB 培养基，50 ℃、170 r/min 下培养2 d。待各菌株长好后，细菌用稀释平板法测菌落数，真菌用血球计数板计孢子数量，并用无菌水调节使各菌液浓度均在109个/ml(真菌)或109cfu/ml(细菌)。

1.2.2 单菌和复合菌产木质纤维降解酶能力 单菌和组合菌均用酶活试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定其降解与木质素和纤维素相关的酶活。

1) β-葡萄糖苷酶(β-GC)活力测定。β-葡萄糖苷酶分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯，后者在400 nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-葡萄糖苷酶活力。

2)外切-β-1,4-葡聚糖酶(C1)活力测定。采用3,5-二硝基水杨酸法测定外切-β-1,4-葡聚糖酶催化微晶纤维素降解产生的还原糖的含量。

3)内切-β-1,4-葡聚糖酶(Cx)活力测定。采用3,5-二硝基水杨酸法测定内切-β-1,4-葡聚糖酶催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。

4)滤纸酶(FPA)活力测定。滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在540 nm 处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算滤纸酶的活力。

5)中性木聚糖酶(NEX)活力测定。NEX 在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540 nm 处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540 nm吸光值增加速率，可计算NEX 活力。

上述公式中，V总：反应体系总体积(ml)；V样：加入反应体系中样本体积(ml)；T：反应时间(min)；ΔA：测定组与对照组的吸光值差。

1.2.3 秸秆粉降解效果研究 称取一定量的秸秆粉置于250 ml 三角瓶中，分别吸取等量的单菌和复合菌剂加入三角瓶，混合均匀，放入50 ℃ 培养箱中培养，15 d 后，烘干样品称重，以不接菌处理为对照，通过失重法计算秸秆粉降解率。

1.2.4 以纯秸秆为原料工厂化堆肥试验 以纯秸秆为原料进行堆肥腐熟试验，设计3 个处理：秸秆，秸秆+单菌，秸秆+复合菌，分别标记为J1、J2、J3。于室外堆场用铲车将物料分成上述的3 个处理，将高效单菌及组合菌群分别按照10 g/kg 比例加入对应物料堆体，调节各处理堆体含水量为650 ～ 700 g/kg；用铲车将混合料转运至发酵仓发酵，建成3 个长×宽×高 =3 m×2 m×1.8 m 的堆体。用铲车每隔5 d 翻堆一次，每次翻堆结束后，取样保存并测定堆肥过程中物料理化性状的变化。

1.2.5 以猪粪秸秆混合物为原料工厂化堆肥试验 以纯秸秆与猪粪混合物原料进行堆肥腐熟试验。纯秸秆和猪粪按照碳氮比为25 进行混合后，设计3 个处理：猪粪+秸秆、猪粪+秸秆+单菌、猪粪+秸秆+复合菌，分别标记为Z1、Z2 和Z3。其余操作同1.2.3。

1.3 工厂化堆肥测定项目与方法

1.3.1 堆体温度测定 每天上午 9:00 和下午15:00 使用水银温度计对堆体中部同一高度(50 cm)随机测量5 个点，取平均温度作为堆体的实际温度。

1.3.2 堆肥样品采集 在整个堆肥过程中，于第0、5、10、15、20、25、30、35、45 天进行样品的采集。采用五点采样法，于堆肥4 个方向和中间位置采集等量样品混合均匀。样品分成3 份，其中2 份分别保存于4 ℃ 和 -80 ℃ 冰箱，另一份自然风干粉碎后待用。

1.3.3 含水量和pH 的测定 用105 ℃ 烘干法测定肥料的含水量，每个样品设置5 次重复。新鲜样品和去离子水以1︰10(m/V)混合，置于水平摇床振荡2 h，静置30 min 后用pH 计测定，每个样品进行5 次重复。

1.3.4 有机质、全氮、全磷和全钾含量的测定 经风干、粉碎、细化、均一化的样品过100 目筛后用锡箔纸包被，使用元素分析仪(Vario EL, Germany)，通过干烧法进行全碳和全氮含量的测定，C/N = 总碳含量/总氮含量。每个样品设置5 次重复。风干样品过 20 目筛参照农业部行业标准NY525—2012《有机肥料》标准[17]，用钼黄法测定全磷(P2O5)含量，用火焰光度法测定全钾(K2O)含量，每个样品进行5 次重复。

1.3.5 发芽指数的测定 新鲜样品与去离子水以1︰10 混合(m/V)，置于水平摇床振荡2 h 后过滤。取5 ml 滤液加入铺有滤纸的培养皿内，每个培养皿内放置20 颗独行菜(Lepidium. apetalum)种子，空白对照为去离子水。培养皿放置于25 ℃ 恒温培养箱中暗培养3 d 后，测定发芽种子数以及根长。每个样品设置5 次重复。

发芽指数(%)=(样品发芽率×样品根长)×100%/(对照发芽率×对照根长)

1.3.6 数据分析 采用Matlab 2016a、SigmaPlot 12.5、Microsoft Excel 2016 软件进行数据统计分析。使用最小显著差异法 (least significant difference,LSD) 检验进行多重比较(P＜0. 05)。

2 结果与分析

2.1 单菌和复合菌产木质纤维降解酶能力

单菌和复合菌在55 ℃ 下产木质纤维降解相关酶活力如表2 所示。复合菌(NJAU-N30+NJAU-F4-5+NJAU-N20)产外切-β-1,4-葡聚糖酶活力达到12.264 µg/(min·ml)，内切-β-1,4-葡聚糖酶活力达到12.630 µg/(min·ml)，β-葡萄糖苷酶的酶活力达到17.501 nmol/(min·ml)，中性木聚糖酶活力达到502.084 nmol/(min·ml)，滤纸酶活力达到0.582 U/ml。在所有的处理中，复合菌处理的各酶活高于所有单菌处理。

表2 单菌和复合菌在55℃下产木质纤维降解酶能力Table 2 Abilities of single and mixed bacteria to produce lignocellulosic degrading enzymes at 55 ℃

2.2 单菌和复合菌对秸秆粉的降解效果及与产木质纤维降解酶能力的相关性

不同菌群组合对秸秆粉降解的影响如图1 所示。在所有单菌处理中，3 号单菌(菌株NJAU-N20)处理降解效率最高，为20.75%；1 号单菌(菌株NJAU-N30)处理其次，降解率为17.49%；2号单菌(菌株NJAU-F4-5)的降解率最低。复合菌处理(NJAU-N30+NJAU-F4-5+NJAU-N20)降解率显著高于单菌处理，为33.76%，表明复合菌处理对秸秆粉的降解率明显大于单菌处理。

从图2 可以看出，所有产木质纤维降解酶与秸秆粉降解都有相关性，其中FPA(滤纸酶)与秸秆粉降解的相关性最为密切，其次是β-GC (β-葡萄糖苷酶)，并且FPA 和β-GC 的值越大，秸秆粉降解率就越高。结合表2 可知，在所有单菌处理中，菌株NJAU-N20处理产FPA 和β-GC 的能力最高，复合菌剂产FPA和β-GC 的能力显著大于所有单菌，这与图1 秸秆粉的降解规律一致，表明单菌和复合菌对秸秆的降解是由FPA 和β-GC 的活性起主导作用。

图1 不同处理对秸秆粉的降解效果Fig. 1 Effects of different treatments on degradation of straw powders

图2 不同菌群组合产木质纤维降解酶能力与秸秆粉降解的相关性Fig. 2 Correlation between abilities of different bacterial groups to produce lignocellulosic degrading enzymes and straw powders degradation

综上所述，选择最优单菌(NJAU-N20)及复合菌剂(NJAU-N30+NJAU-F4-5+NJAU-N20)应用到随后的工厂化原位堆肥研究。

2.3 秸秆堆肥过程中理化性质的变化

2.3.1 秸秆堆肥过程中温度的变化 从图3 可以看出，各个处理堆肥温度均经历了3 个阶段(升温、高温和降温)，50 ℃以上持续的时间均超过 20 d。添加复合菌剂的处理起堆后升温最快，其次是添加单菌处理的堆体。添加复合菌剂的J3 处理第10 天温度即达到最高点74.5 ℃，直到第40 天温度开始下降，进入降温期。

图3 秸秆堆肥过程中不同处理的温度变化Fig. 3 Variations of temperature in different treatments duringcomposting process of pure straws

2.3.2 秸秆堆肥过程中含水量和pH 的变化 由图4 可知，随着秸秆堆肥的进行，3 个处理的含水量均在下降，添加外源菌剂的J3 和J2 处理下降速度均高于J1，其中J3 效率更高，含水量从702.4 g/kg 下降到290.2 g/kg，符合农业部行业标准NY525—2012《有机肥料》标准[17]。3 个堆体pH 变化趋势一致，在堆肥初期均大幅升高，在第20 天左右达到最大值，随后下降，后期趋于稳定。其中，堆体J3 的pH 变化幅度最大，至堆肥结束，堆体稳定在6.44 左右。

2.3.3 秸秆堆肥过程中有机质含量和发芽率的变化 从图5 可以看出，在堆肥过程中，3 个堆体有机质含量均呈下降趋势，J3 处理的有机质量下降最多，其次为J2 处理，至堆肥结束，J1、J2 和J3的有机质含量分别为699.1、583.6、520.3 g/kg。在堆肥过程中，3 个堆体的发芽指数呈明显上升趋势，J3和J2 的发芽指数始终高于J1。堆肥前期，J3 和J2处理的发芽指数相差不大，呈交替上升趋势；至25 d，J3 处理的发芽指数高于J2；在第35 天时，J3 处理的发芽指数最高，达到87.36%，而J2 处理为76.22%；至堆肥结束，J3 发芽指数达到93.45%。

图4 秸秆堆肥过程中含水量和pH 的变化Fig. 4 Variations of water content and pH during composting of pure straws

图5 秸秆堆肥过程中有机质含量和发芽指数的变化Fig. 5 Variations of organic matter and germination index during composting of pure straws

2.3.4 秸秆堆肥过程中总氮、总磷和总钾含量的变化 从表3 可以看出，3 个处理的养分含量均高于初始样品养分含量。至堆肥结束时3 个处理的养分含量具有差异，J3 堆体的全氮含量最高，与J2 和J1 均有显著性差异；J3 处理的全磷含量显著高于J2 和J1，J2 处理的全磷显著含量高于J1；3 个处理的全钾含量差异性不大，其中J3 处理略高。堆肥结束时J3 处理的总养分含量(N+P2O5+K2O)最高。

表3 秸秆堆肥过程中养分含量的变化(g/kg)Table 3 Variations of nutrient contents during composting of pure straws

2.4 秸秆猪粪混合物堆肥过程中理化性质的变化

2.4.1 秸秆猪粪混合物堆肥过程中温度的变化 从图6 可知，各处理堆肥温度均经历了升温、高温和降温期3 个阶段，50 ℃以上持续时间均超过20 d，添加复合菌剂的处理起堆后升温最快，其次是添加单菌处理堆体，高温期 Z3 处理温度高于 Z1和 Z2 处理，Z3 处理先于Z1 和Z2 处理进入降温期。

2.4.2 秸秆猪粪混合物堆肥过程中含水量和pH 的变化 如图7 所示，随着堆肥的进行，3 个处理的含水量均在下降，其中添加复合菌堆体Z3 含水量下降最快，其次为添加单菌的处理Z2；在堆肥结束时3个堆体的含水量均小于300 g/kg，符合国家标准NY525—2012[17]。3 个堆体的pH 变化趋势大致相同，在堆肥初期均大幅升高，在第20 天左右达到最大值，随后下降，后期趋于稳定。在堆肥结束时，Z3 处理的pH 为7.24。

2.4.3 秸秆猪粪混合物堆肥过程中有机质含量和发芽率的变化 由图8 可知，堆肥过程中3 个堆体的有机质含量均呈下降趋势，Z3 处理的有机质含量下降最快，至堆肥结束，Z1、Z2 和Z3 的有机质含量分别为475.7、477.7、487.6 g/kg。随着堆肥的进行，3 个堆体的发芽指数呈明显上升趋势，Z3 处理的发芽指数始终高于Z2 和Z1，至堆肥结束时，Z3 堆体发芽指数为96.22%。

2.4.4 秸秆猪粪混合物堆肥过程中总氮、总磷和总钾含量的变化 如表4 所示，3 个处理的养分含量均高于初始样品养分含量。在堆肥结束时，3 个处理的养分含量具有差异，Z3 处理的全氮含量最高，且显著高于Z1 和Z2 处理；Z3 和Z2 处理的全磷含量与Z1 处理有显著性差异，Z3 处理的全氮含量最高；3个处理间的全钾含量无显著性差异，但Z3 处理的全钾含量更高。在堆肥结束时Z3 处理的总养分含量(N+P2O5+K2O)最高，达到了50 g/kg。

图6 秸秆猪粪混合物堆肥过程中不同处理的温度变化Fig. 6 Variations of temperature in different treatments during composting process of mixture of straws and pig manure

图7 秸秆猪粪混合物堆肥过程中含水量和pH 的变化Fig. 7 Variations of water content and pH during composting of mixture of straws and pig manure

图8 猪粪秸秆混合物堆肥过程中有机质和发芽指数的变化Fig. 8 Variations of organic matter and germination index during composting of mixture of straws and pig manure

表4 猪粪秸秆混合物堆肥过程中养分含量的变化(g/kg)Table 4 Variations of nutrient contents during composting of mixture of straws and pig manure

3 讨论

为针对秸秆资源化利用，开发纯秸秆和秸秆配伍畜禽粪便高效堆肥工艺，本研究首先测定单菌和复合菌在降解木质纤维过程中的分泌酶的活性并通过室内对秸秆粉的降解试验，筛选得到了最优单菌及复合菌剂，其中复合菌处理的各酶活高于所有其组成单菌的酶活并且复合菌对秸秆粉的降解效果显著优于单菌效果，这与前人的研究结果一致[18]，由真菌、细菌组成的混合菌分解纤维素的能力明显强于其中任何一个单一菌株。对单菌和复合菌的秸秆降解效果与分泌酶的活性进行相关性分析，发现所有产木质纤维降解酶与秸秆降解有相关性，其中FPA(滤纸酶)与秸秆降解的相关性最为密切，其次是β-GC (β-葡萄糖苷酶)，并且FPA 和β-GC 的值越大，秸秆降解率就越高，表明单菌和复合菌对秸秆的降解是由FPA 和β-GC 的活性起主导作用。周月明等[19]的研究发现以固态纤维素类为降解底物的酶，其活性可以反映总纤维素类物质的降解效果，其中滤纸酶可以降解不溶性纤维素及半纤维素，β-葡萄糖苷酶可以降解可溶性纤维素及半纤维素。秸秆是由大量的有机物和少量的无机物及水所组成的，其有机物的主要成分为木质纤维类的碳水化合物[20]，因此，复合菌产生的更为复杂和多样性的木质纤维降解酶通过协同作用产生更加优异的降解效果[21]。

在工厂化原位堆肥试验中，无论是纯秸秆还是秸秆畜禽粪污混合物堆肥的温度在60 ℃ 以上均维持了超过40 d，对堆肥而言，温度是影响微生物活动和堆肥腐熟的重要因素。本试验中各处理温度均能达到60 ℃ 以上，且堆肥过程中60 ℃ 以上持续的时间均超过20 d，满足堆肥无害化要求[22]。另外，无论哪种原料，接种微生物菌剂的堆体温度变化更快，更早地进入高温期和降温期，尤其以复合菌剂处理效果更优，这与李天枢[23]的研究结果一致，堆肥微生物菌剂的添加，提高了最高堆温和堆体的腐熟效率，因此，无论是纯秸秆还是秸秆与畜禽粪污的混合物，复合菌剂的添加，均能够稳定得发挥作用。

所有堆体pH 均在堆肥初期大幅升高，随后开始出现下降，至后期趋于稳定。这是由于随着堆肥进行，蛋白质水解氨化，挥发的部分氨造成碱性环境。堆肥后期，随着氨的挥发、蛋白质有机物的彻底降解以及硝化作用的进行，pH 逐渐降低，这一结论与姜继韶和黄懿梅[24]堆肥研究结论一致。过高或过低的pH 均会抑制微生物活性[25]，本研究中，无论是纯秸秆还是秸秆与畜禽粪污的混合物堆肥均具备合适的堆肥pH 范围。所有堆体含水量均呈下降趋势，这是由于堆肥过程中的高温和通气作用伴随着热量和气体挥发以及微生物的分解作用造成水分损失[26]。堆肥微生物菌剂的添加，加快了堆体的升温速度，促进了水分的蒸发，降低了堆体的含水量，这同样证实，无论是纯秸秆还是秸秆与畜禽粪污的混合物，堆肥菌剂的添加均驱动了堆肥的进行，复合菌效果更优。

在两种原料的堆肥试验中，加了复合微生物菌剂处理的发芽指数的升高速率显著高于添加单菌和空白处理。Raj 和Antil[27]指出许多植物种子在堆肥原料和未腐熟堆肥萃取液中生长受到抑制，而在腐熟的堆肥中生长得到促进，一般发芽指数大于80% 即可认为有机肥基本腐熟。虽然，本试验中，所有堆肥处理结束时，发芽指数均符合此标准，但接种复合菌剂的处理升高速率更快，体现出明显的促进堆肥无害化效果。

堆肥过程是一个复杂的生物化学过程，伴随堆肥化进程，有机物质在微生物作用下发生矿化和腐殖化[28]，所有堆体的有机质含量不断减少，被微生物代谢活动所利用，J3 和Z3 复合菌处理微生物活动剧烈，下降最多。全氮、全磷和全钾含量比堆肥初始时均有所增加，这是由于微生物的活动导致堆肥的总干物质量下降和部分养分的释放[29]。至堆肥结束时，秸秆和秸秆猪粪各处理间的总养分具有微弱差异，氮磷钾含量均为复合菌处理＞单菌处理＞不加菌处理。

4 结论

1)通过测定单菌和复合菌在降解木质纤维过程中分泌酶的活性和室内秸秆粉的降解试验，筛选得到高效降解木质纤维的最优单菌及复合菌剂，复合菌处理的各酶活高于所有其组成单菌的酶活并且对秸秆粉的降解效果显著优于复合菌剂中任一单菌及不添加外源菌的对照，并且所有产木质纤维降解酶与秸秆降解有相关性，其中滤纸酶和β-葡萄糖苷酶的活性起主导作用。

2)无论是纯秸秆还是秸秆猪粪混合物为原料堆肥，添加复合菌剂堆体均升温速率最快，高温期温度最高，后熟期降温最快；接复合菌处理的发芽率均在第25 天高于接单菌处理和对照，表明接种复合菌剂能够有效驱动堆肥的进行。

3)至堆肥结束时，添加复合菌剂处理的堆体氮磷钾养分含量高于接单菌处理和不接菌对照，且所有堆体的养分含量均高于堆肥初始养分含量。