口源性口臭相关微生物及挥发性含硫化合物的产生机制

单 晨,叶 玮

口臭是指呼吸时口腔发出的不良气味，是影响人们进行社会交往和造成心理障碍的原因之一。在一些国家和地区，口臭已经成为龋病和牙周病后，口腔科患者就诊的第三大原因[1]。导致口臭的气体主要有挥发性含硫化合物(volatile sulfur compounds, VSCs)，如硫化氢、甲基硫醇和二甲基硫醚，此外还有挥发性芳香烃复合物，如吲哚、甲基吲哚，有机酸如乙酸、丙酸，胺类如尸胺、腐胺等有机物也可引起口臭[2]。其中90%的口臭为口源性口臭，其病因有深龋、牙周病、口腔感染、种植体周围炎、冠周炎、黏膜溃疡、潴留的食物或残渣、舌苔等[3]。研究发现，口腔内的多种细菌与口臭的产生紧密相关[4]，了解口臭相关微生物及其产生挥发性硫化物的机制将有助于口臭的临床治疗。

鉴于此，本文就口源性口臭相关微生物及VSC产生机制作一综述，以期厘清其发病机制，为口臭的病因学诊断及治疗提供新的思路。

1 口源性口臭相关微生物

致臭气体主要由口腔内寄居的产臭细菌分解含硫食物残渣、唾液、血液和上皮细胞产生[5]。口腔独特的解剖结构、局部适宜的温度和充足的营养对口源性口臭相关的细菌繁殖和生长非常重要[6]。唾液是微生物的贮存库，经检测，口腔中1 mL唾液的含菌量可达1×108个，它们主要来源于龈沟、牙周袋、舌背和其他黏膜表面的菌斑生物膜，并以悬浮的形式播散[7]。舌苔主要由脱落的上皮细胞、来自牙周袋的白细胞、血液代谢产物、食物残渣和细菌构成。舌背表面的舌乳头形态结构，尤其是舌乳头的深度影响舌生物膜的构成。舌背黏膜相对其他部位的口腔黏膜能容纳更多的细菌，舌背单个脱落的上皮细胞能容纳超过100个细菌，而其他口腔黏膜表面的单个脱落上皮细胞仅能容纳25个细菌[8]。龈沟内渗出的龈沟液为产臭菌提供丰富的底物，龈沟也是菌斑附着的主要部位。特别对于牙周炎患者，深而出血的牙周袋为产臭细菌提供了良好的生长繁殖环境。

目前认为，口源性口臭源于口腔微生态的平衡被打破，口腔内菌群失调造成产臭厌氧菌比例的增加，致臭菌含硫蛋白代谢产物释放增多，从而引起口臭[9]。随着微生物培养依赖性菌种检测技术和以分子生物学为基础的非培养依赖性菌种检测技术的不断发展，近年来有多篇关于口源性口臭相关微生物的研究面世。

1.1 牙周致病菌

牙周病患者通常同时有口臭的困扰，多篇临床研究探究口臭与牙周病发展之间的关系。有假说称VSC可以加速牙周组织的破坏，而牙周袋的形态也为产硫细菌提供了理想的环境[10]。早在1990年，Persson等[11]证实了牙周致病菌如齿垢密螺旋体、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌、福赛类杆菌和具核梭杆菌能从唾液蛋白中的半胱氨酸和甲硫氨酸中产生硫化氢和甲基硫醇。这之后，Mineoka等[12]研究也表明唾液中的牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、福赛坦氏菌的量与牙周健康及口腔气体中的VSC水平相关联，经治疗，随着上述细菌的减少，牙周健康情况得到改善，同时口腔气体中的VSC降低。Stephen等[13]研究发现与慢性牙周炎相关的口臭可能是由于舌生态的改变，而这改变受到牙周菌群微环境改变的影响。Apatzidou等[14]研究证实了人群中口臭与牙周病的关联性，口臭在牙龈炎和牙周炎的病人中高发。Takeuchi等[15]也为探究牙周炎患者的口臭与牙周致病菌水平的关联性作了相关研究，结果显示唾液中的齿垢密螺旋体和福赛坦氏菌水平与口臭相关联，唾液中的牙龈卟啉单胞菌比例与牙周炎相关联。有足够证据[16]提示牙周病会增加口臭的严重程度，牙周炎通过VSC产生部位的增加(牙缝间和龈下区域)、含硫底物的增加(脱落的上皮细胞和白细胞)以及甲硫氨酸的增加使口臭程度恶化。

1.2 Solobacterium moorei (S.moorei)

S.moorei是一种革兰阳性的厌氧菌，近来被认为是与口臭相关联的特异性细菌[17]。S.moorei在多篇研究中被证实广泛存在于口臭组样本中，而在健康对照组中较少被检测出。Haraszthy等对21例口臭患者和36例健康对照组舌后部样本中的S.moorei进行分离纯化，16S rDNA测序，结果显示口臭组样本中S.moorei的检出率为100%，而对照组中的检出率仅为14%，并且发现S.moorei的存在与口臭的感官指标相关性最高，与VSC的水平、舌苔指数也有很大的相关性，此外所有S.moorei菌株都可以在严格厌氧琼脂和OOPS介质培养中产生硫化氢[17]。Riggio等[18]运用相同测序方法也发现S.moorei仅在口臭组舌苔样本中被检测出。Ren等[19]运用细菌16S rRNA基因测序和宏基因测序方法比较有口臭的儿童和健康儿童舌苔细菌群落的差异，显示S.moorei在口臭样本中的含量高于对照组。Tanabe等[17]通过体外试验证实了S.moorei通过产生VSC致臭。

1.3 唾液链球菌

唾液链球菌属于口腔正常菌群，可参与宿主局部生物屏障的构成，维持宿主口腔菌群的生态平衡。研究显示，与健康者相比，口臭者口腔中唾液链球菌数量较少。Riggio等[18]运用16S rRNA基因测序，结果亦表明唾液链球菌是健康对照组舌背上的优势菌。研究表明，唾液链球菌至少可以产生两种羊毛硫样细菌素：唾液素A和唾液素B。对其他菌株(通常为近缘菌株)而言，唾液素A和唾液素B是致死的物质，其化学基质是蛋白质或蛋白质的糖或脂的复合物。不同细菌素作用方式不同，比如可抑制蛋白质合成或影响细胞的DNA。唾液素A是抑菌剂，唾液素B是杀菌剂，它们皆可以对产VSC菌进行抑制作用。

1.4 念珠菌

念珠菌为单细胞酵母样真菌，革兰染色阳性。虽然健康人可带有念珠菌，但并不发病，当宿主防御功能降低以后，这种非致病性念珠菌转化为致病性念珠菌，故念珠菌为条件致病菌[20]。口腔卫生情况的恶化及各种原因导致的皮肤黏膜屏障作用降低，如艾滋病、长期使用广谱抗生素、放疗后、糖皮质激素的长期应用等，机体可能受到念珠菌性口炎的困扰[21]。Koga等[22]运用针对念珠菌的培养方法发现口臭患者舌苔样本的念珠菌阳性检出率为25.2%，且白色念珠菌为最高检出率的菌种。同时在白色念珠菌强阳性的个体中，甲基硫醇的浓度也较高。

1.5 其他厌氧菌

包括纤毛菌(G-)、消化链球菌(G+)、梭杆菌(G-)、韦荣球菌(G-)、放线菌(G+)、真杆菌(G+)等。

Ren、Takeshita等[19,23]运用细菌16S rRNA基因测序方法均发现纤毛菌在口臭组唾液或舌苔样本中的相对丰度显著高于对照健康组。Ren、Takeshita等[19,23]通过比较口臭组和对照组唾液或舌苔细菌样本，发现消化链球菌在口臭组中含量显著高于对照组。Takeshita等[23]比较了口臭组和健康对照组唾液样本中细菌，分析表明梭杆菌的含量在口臭组中显著较高；Ebrahim-Saraie等[24]也研究发现相较正常人群，口臭组牙周袋中的梭杆菌检出率更高。Haraszthy等[25]对口臭组和健康对照组舌苔上细菌的研究显示韦荣球菌在口臭人群中含量较高。Haraszthy、Ren等[25-26]在检测了口臭组和健康对照组舌苔及龈上菌斑中细菌差异后，发现放线菌在口臭组中占更高比重。Takeshita、Haraszthy等[23,25]研究发现口臭组舌苔和唾液样本中的真杆菌所占比例显著高于健康对照组。

2 口源性口臭的VSC产生机制

致臭气体大部分为细菌分解含硫氨基酸得到的挥发性含硫化合物(VSCs)。VSC包括硫化氢(H2S)、甲基硫醇(CH3SH)和二甲基硫醚。在口源性口臭中，硫化氢和甲基硫醇为主要的致臭气体，二甲基硫醚为非口源性口臭中主要的致臭气体[27]。Sterer提出口臭的产生包括了两步骤：①糖蛋白的去糖基化；②蛋白质核心的水解和氨基酸的利用，产生VSC[28]。

2.1 糖蛋白的去糖基化

即移去碳水化合物的侧链。糖蛋白的碳水化合物侧链分解由一系列糖苷酶催化，包括β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰基半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。Sterer等对含有β-半乳糖苷酶的唾液在有或没有糖苷抑制剂的条件下预培养。结果显示：外源性添加糖苷酶β-半乳糖苷酶可以促进唾液糖蛋白的降解，该过程伴随着VSC的产生；而糖苷抑制剂可以抑制这种作用[28]。Yoneda等也研究发现β-半乳糖苷酶活性与口臭强度(感官计分、便携式硫化物检测器计分和VSC浓度)正相关，且与舌苔覆盖的面积和厚度相关。这些研究结果提示：唾液糖蛋白的去糖基化是后续水解蛋白质的细菌降解糖蛋白的重要前提步骤[29]。研究发现绿茶中的茶多酚可以通过剂量依赖性地抑制S.moorei中的β-半乳糖苷酶，从而降低口臭的程度[30]。Sterer等[28]在后续研究中指出了革兰阳性和革兰阴性细菌在产生VSC中的确切作用，阐述了革兰阳性细菌在生物膜的外表面产生β-半乳糖苷酶，催化了糖蛋白的去糖基化；而革兰阴性细菌在生物膜的深层中分解含硫氨基酸产生VSC。口腔革兰阴性厌氧菌常常被认为是口臭的唯一来源。但是，生物膜外表面的革兰阳性且能产生β-半乳糖苷酶的细菌也参与到口臭的产生这一可能，对解释之前观察到的数种针对革兰阳性菌的抗生素及仅针对口腔生物膜表层的漱口水对口臭降低有效这一事实有帮助[31]。且患者口腔中β-半乳糖苷酶含量的检测或可成为诊断口臭的方法之一。

2.2 含硫氨基酸分解产生H2S和CH3SH

2.2.1 H2S的产生

细菌产硫化氢主要是降解含硫氨基酸，根据参与的酶不同，最终代谢产物也不同。半胱氨酸降解的其中一条通路是依赖5′磷酸吡哆醛辅酶的L-半胱氨酸脱巯基酶参与的，含α，β消除活性，产物为硫化氢、丙酮酸和氨。很多口腔细菌基因组都可编码产生L-半胱氨酸脱巯基酶，如具核梭杆菌中的cdl基因，齿垢密螺旋体中的hly基因，中间普氏菌中的lcs基因。此外，咽峡炎链球菌和中间链球菌可以利用由其基因组中的lcd基因编码产生胱硫醚酶分解L-胱硫醚和半胱氨酸产生硫化氢[32]。Basic等将多种厌氧菌在含L-半胱氨酸的培养基中培养，进而检测其产生硫化氢的量，结果显示梭杆菌属产生硫化氢的速率最快且量最大，Tannerae普氏菌能产生大量的硫化氢，齿垢密螺旋体亦能在较慢的速率下产生大量硫化氢[33]。

2.2.2 CH3SH的产生

L-甲硫氨酸-α-脱氨基-γ-巯基乙醇-裂解酶(METase)通过α，γ消除作用，分解甲硫氨酸产生甲基硫醇，其他产物包括α-丁酮酸、氨。Yoshimura等[34]研究发现牙龈卟啉单胞菌具有产甲基硫醇的能力，mgl基因编码产生牙龈卟啉单胞菌W83株的METase酶。mgl基因约1 200 bp，编码43.3 ku的蛋白即METase酶，且人为破坏mgl基因而造成METase酶缺失的变异株产生甲基硫醇的量明显下降。Ouhara等也研究发现牙龈卟啉单胞菌产生甲基硫醇的量与mglmRNA表达的量成正相关[35]。

3 总 结

综上所述，随着细菌检测技术的发展，与口源性口臭相关的微生物逐渐明了，除了公认的牙周致病菌外，S.moorei、唾液链球菌、念珠菌及其他一些口腔厌氧菌与口臭关联的证据逐渐积累了起来。不同研究对于口臭相关细菌菌群结论的差异主要源自两个方面：细菌检测的方法差异、研究对象是否纳入牙周病患者。VSC(可挥发性含硫化合物)中的硫化氢和甲基硫醇作为口源性口臭的主要产臭气体，它们的产生机制主要包括了糖蛋白的去糖基化和含硫蛋白的降解这两个重要步骤。这两个步骤又与细菌的作用密切相关，糖蛋白的去糖基化主要依赖革兰阳性细菌产生的β-半乳糖苷酶；而含硫蛋白的降解主要依赖革兰阴性细菌的L-半胱氨酸脱巯基酶分解半胱氨酸产生硫化氢和L-甲硫氨酸-α-脱氨基-γ-巯基乙醇-裂解酶分解甲硫氨酸产生甲基硫醇。这些机制的厘清，对口臭的治疗具有一定指导意义。