两种灭菌方法对离体牙灭菌效果及粘接强度影响的研究

史 璐，李 豪，郭 笑，王 鹏，马佳琳

离体牙被广泛应用于口腔医学的实验教学和科学研究中，尤其是在牙本质粘接剂粘接性能的研究中[1-2]。2003年美国疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention, CDC)发布的《牙科医疗机构感染控制指南》中明确规定：离体牙必须经消毒灭菌处理后方可用于口腔医学实验教学和科学研究[3-4]；推荐使用高压蒸汽灭菌121 ℃，40 min对离体牙进行灭菌，对有银汞合金充填物的离体牙推荐使用4%甲醛浸泡两周。但甲醛是原浆毒物质且具有致癌、致畸、致突变的生物学作用，不宜用于教研用离体牙的灭菌。尽管多种消毒灭菌方法被尝试用于离体牙的消毒灭菌处理，但由于牙齿结构的复杂性，目前尚缺乏一种既能够达到灭菌效果，又能够最小限度影响牙体硬组织结构的灭菌方法[2,5-6]。

低温等离子体灭菌是新一代灭菌技术。其基本原理是工作气体在外加直流或交流电场的作用下电离产生低温等离子体[7]。目前，有关低温等离子体灭菌技术用于离体牙灭菌处理的研究尚罕见报道。本研究拟采用过氧化氢低温等离子体灭菌技术处理离体牙，检测其灭菌效果和对牙本质粘接强度的影响，并与高温高压蒸汽灭菌法进行比较，探寻教学科研用离体牙的处理方法。

1 材料与方法

1.1 实验牙的收集与分组

收集40颗因正畸拔除的前磨牙(患者年龄16～20岁)，要求牙体完整，无龋、无充填物及其他缺损。拔除后立即在流动水下用牙周刮治器去除附着的碎屑，然后用湿纱布包裹置于-20 ℃冻存，备用。将牙齿随机分为两组：高温高压蒸汽灭菌组和过氧化氢低温等离子体灭菌组，每组20颗(10颗用于灭菌效果评价，10颗用于剪切粘接强度检测)。另取10颗新鲜拔除的前磨牙，于30 min内使用，作为剪切粘接强度实验对照。

1.2 主要仪器与试剂

自酸蚀二步法粘接剂可乐丽SE Bond包括粘合用处理剂(批号1E0127)和粘合剂(批号190205)；可乐丽前后牙通用光固化复合树脂A2 色(批号6P061)均为日本可乐丽则武齿科株式会社产品。OxoidTM营养琼脂培养基(货号CM0003B)、OxoidTM普通肉汤培养基(货号CM0001B)、PBS(pH =7.4，货号10010049)均购自美国赛默飞世尔科技有限公司。金黄色葡萄球菌(ATCC6538)(编号1.2465)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。高温高压灭菌柜PYM712(山东新华医疗器械股份有限公司)；过氧化氢低温等离子体灭菌器LK/MJQ-100(成都老肯医疗科技股份有限公司)；垂直流洁净工作台JB-CJ-1500FX(苏州佳宝净化工程设备有限公司)；二氧化碳恒温培养箱MCO-15AC(日本三洋)；万能试验机AGS-500N(日本岛津制作所)；低速精密切割机(上海万衡精密仪器有限公司)；Spectrum 800光固化机(美国Dentsply 公司)；Leica M320 F12口腔手术显微镜(德国Leica)。

1.3 方法

1.3.1 灭菌方法 取出冻存的离体牙，湿纱布包裹，室温下复温30 min，用带化学指示条的特卫强袋卷封装后进行消毒灭菌处理。高温高压蒸汽灭菌条件为：121 ℃/20 psi，40 min。低温过氧化氢等离子体灭菌条件为：选择标准程序，过氧化氢用量4 mL/次，灭菌舱工作温度35～55 ℃，灭菌舱工作中最小真空度50 Pa，灭菌周期分为2次循环，共用时55 min。

1.3.2 灭菌效果评价 在超净工作台中无菌条件下进行。为检测牙齿表面及髓腔内灭菌效果，用无菌拔牙钳将经灭菌处理的牙齿夹开，暴露髓腔。细菌采样及结果判定均根据《中华人民共和国医院消毒卫生标准》中对消毒灭菌的相关要求进行[8]。用浸有无菌0.03 mol/L PBS的棉拭子横竖往返涂抹牙齿表面及髓腔各10次，并随之转动棉拭子，取样范围为牙齿全部表面及整个髓腔。将棉拭子(剪去手接触部分)放入装有10 mL无菌生理盐水洗脱液的试管中。每一样本洗脱液接种2个平皿，每个平皿接种1 mL。将45 ℃融化的营养琼脂培养基15～20 mL倾注于已加入样液的平皿中。37 ℃恒温培养箱培养48 h。检测时同时设阴性、阳性对照组。阴性对照组：①用同批营养琼脂培养基倾注平板直接培养；②分别吸取1 mL同批洗脱液与PBS各2份，分别接种于平皿内，倾注营养琼脂培养基进行培养。阳性对照组：接种1 mL金黄色葡萄球菌(ATCC6538)18 h新鲜肉汤培养物于平皿内，倾注营养琼脂培养基进行培养。

结果判定：阳性对照组培养阳性，阴性对照组培养阴性，实验组培养阴性，判定为灭菌合格；阳性对照组培养阳性，阴性对照组培养阴性，实验组培养阳性，则灭菌不合格。每种灭菌方法，只要有一个样本被判定为灭菌不合格，则认为该灭菌方法不适用于离体牙灭菌。

图1 利用自制圆环在牙本质面上粘接树脂

1.3.4 剪切粘接强度测试 将试件固定在电子万能测试机上，使剪切力方向与粘接面平行，试验机压头正对树脂柱。设置加载速度恒定为0.5 mm/min，树脂柱脱落时，计算机显示的最大值即剪切力值(N)，根据剪切粘接强度=剪切力/粘接面积，1 MPa=1 N/mm2，计算剪切粘接强度，以MPa表示。

1.4 统计学方法

各组数据以均数±标准差表示，采用SPSS 20.0统计软件对实验数据进行处理。Kruskal-Wallis 检验比较总体样本均数及Dunnett-t检验行两两比较，P<0.05为差异具有显著性。

2 结 果

经检测，高温高压蒸汽灭菌组和低温过氧化氢等离子体灭菌组的全部样本灭菌结果均判定为合格，说明两种灭菌方法均可用于离体牙消毒灭菌(图2)。

a：高温高压组；b：低温等离子体组；c：金黄色葡萄球菌(阳性对照)；d：营养琼脂培养基；e：洗脱液；f：PBS；d、e、f为阴性对照

剪切粘接强度测试结果见图3。相比于对照组新鲜拔除的离体牙((64.37±4.88)MPa)，高温高压组((47.66±1.22)MPa)和低温等离子体组((36.88±2.61)MPa)剪切粘接强度均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。低温等离子体组剪切粘接强度低于高温高压组，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

在口腔医学实验教学中，相比于树脂模块牙，离体牙的解剖形态和硬度更接近于患者口腔内的天然牙。学生使用离体牙进行牙体制备、根管治疗等临床技能操作培训时能够更好地体会钻磨天然牙时的手感。但是，离体牙含有大量病原微生物，具有空间传染、急性传染和潜伏性传染等危险特征，且有机成分含量多，容易变质。实习医学生和使用离体牙从事研究工作的人员属于可能接触血源性病原体的主要人群之一。他们在进行操作培训时可能由于手接触、吸入钻磨牙齿时产生的粉末、喷溅的液体进入眼、口、鼻中而接触到潜在的传染性物质。因此，医学院一方面应当加强对医学生及科研人员血源性病原体职业接触防护的教育，另一方面，应当按照普遍预防的原则对应用于教学、科研的离体牙进行灭菌。多种物理和化学消毒灭菌方法被尝试处理离体牙，例如煮沸消毒法，季胺、5.25%次氯酸钠、3%过氧化氢、2% 戊二醛、0.1%麝香草酚浸泡等。但多数研究结果表明，这些方法不能达到可靠的灭菌效果[9]。离体牙的牙釉质、牙本质、牙骨质及牙髓组织当中都可能存在病原菌，因此用于牙齿灭菌的方法应不仅能使牙齿表面灭菌，还应当具有穿透性，能够使深部的牙体硬组织及牙髓组织均达到灭菌效果。过氧化氢低温等离子体灭菌技术的作用原理是：在一定真空度和温度条件下注入含550 g/L以上过氧化氢溶液，经过汽化、穿透、覆盖到管腔器械的内外表面，在45～55 ℃温度协同下杀灭微生物；最后启动等离子电源，一方面产生消毒因子协同作用达到最终灭菌水平，另一方面利用等离子体快速解离器械表面的过氧化氢变成水和氧气，从而达到消除灭菌介质残留的作用[10]。低温等离子体灭菌可以通过控制放电室的温度，使其可以在常温下进行，因此可以对不能用高温高压消毒的材料进行消毒，且效率高，时间短。另外产生等离子体的气体可以完全采用无毒气体，不会对人体和环境产生危害[8]。本实验结果表明低温等离子体灭菌技术亦可用于离体牙的灭菌处理。使用该项技术对有银汞合金等充填物的离体牙进行灭菌处理时，既能够避免甲醛的毒性，又能够避免因高温高压导致充填材料分解带来的危害[11]。因此，相比于高温高压蒸汽灭菌法，低温等离子体灭菌技术在离体牙的灭菌处理方面适用范围更加广泛。

SD：标准差(standard deviation)；*：P<0.05

本次实验中，相比于新鲜拔除的离体牙，经高温高压灭菌处理后，粘接强度明显下降。低温等离子体组粘接强度下降更为明显。离体牙的储存方式和消毒灭菌方式影响粘接强度的确切机制尚不清楚。牙体硬组织的一个重要特性是显微硬度。研究显示：高温高压蒸汽灭菌可导致牙釉质和牙本质显微硬度明显降低，扫描电镜观察见牙釉质表面孔隙增加，开放的牙本质小管数量增加[6]。有学者认为可能是由于较高的温度和压力导致牙本质中有机成分变性，影响了牙本质的显微硬度[12]。有学者推测牙体硬组织显微硬度的降低可能意味着牙体硬组织中无机物和(或)有机物的溶解或降解，从而导致牙本质渗透性增加，并对粘接过程造成影响[13]。最近的研究显示：高温高压蒸汽灭菌降低牙本质渗透性66%，场发射扫描电镜观察发现牙本质胶原纤维网塌陷[14]。离体牙灭菌方法对牙体硬组织中无机物含量、牙本质胶原纤维结构、牙本质表面自由能等方面的影响还需深入研究，以揭示其对粘接强度影响的机制。本实验中使用的低温等离子体灭菌技术，虽然温度和压力都明显低于高温高压蒸汽灭菌技术，但却导致粘接强度下降最为显著，这是否因牙齿中残留的过氧化氢所导致还需进一步研究[15]。

患者年龄对牙本质显微结构、硬度和化学组成的影响表现为：随着年龄的增长，牙本质小管阻塞率、牙本质的硬度和矿物质的含量增加[16]。不同年龄组牙齿酸蚀后表面形态及粘结界面扫描电镜观察显示：年轻恒牙组(牙根发育2/3～3/4)的混合层致密均匀，树脂突密而长。青年恒牙组(25～40岁)混合层较年轻组疏松，厚度不均匀，树脂突长度较均一。老年恒牙组(60岁以上)混合层疏松，薄厚不均，树脂突较少且长度较短，并有树脂突断裂[17]。本次实验使用的离体牙来自年龄16～20岁的患者,避免了因患者年龄跨度较大可能导致的实验误差。

综上，本次实验结果表明：高温高压蒸汽灭菌法和过氧化氢低温等离子体灭菌技术均可用于教学用离体牙的灭菌处理，用于粘接强度实验研究的离体牙不宜采用过氧化氢低温等离子体灭菌技术灭菌。