FGF-21、MIP-2在特发性肺纤维化中的变化及临床意义*

丁秀秀，谢甜，黄奕江

（海南省人民医院 呼吸与危重症医学科，海南 海口 570311）

特发性肺纤维化是一种慢性间质性肺病，其发病率、致死率均较高，严重威胁患者生命安全[1-2]。该病影像学下可见肺基底部斑片状、网格状玻璃影，支气管牵拉或扩张，严重者可发生蜂窝状改变[3]；临床主要表现为咳嗽、呼吸困难，严重者可发生呼吸衰竭，甚至死亡[4-5]。目前，关于特发性肺纤维化的发病机制尚未明确，因此，寻找其发病原因有利于早期预防、早期干预，对特发性肺纤维化具有重要临床意义。

氧化应激反应时，活性氧簇大量产生，而纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor-21, FGF-21）可抑制活性氧簇从而抑制一系列应激反应[6]。相关研究发现，FGF-21 与肾纤维化具有相关性[7]。但目前关于FGF-21 在特发性肺纤维化中的变化及其临床意义研究甚少。巨噬细胞炎性蛋白2（macrophage inflammatory protein-2, MIP-2）是肺泡巨噬细胞以及呼吸道上皮细胞分泌的蛋白质产物，部分研究发现，MIP-2 在博来霉素致肺纤维化中起重要作用[8]，但目前关于MIP-2 在特发性肺纤维化中变化的研究较少。因此，本研究通过检测特发性肺纤维化患者中肺组织FGF-21、MIP-2的表达的变化，研究两者在特发性肺纤维化中的作用及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据《特发性肺纤维化诊断和治疗中国专家共识》特发性肺纤维的诊断标准[2]，选取2013年12月— 2018年12月海南省人民医院确诊的特发性肺纤维化患者80例。其中，男性43例，女性37例；年龄50 ～ 80 岁，平均（69.73±5.67）岁。

排除标准：①其他呼吸系统疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、哮喘、肺炎、肺栓塞、肺结核、肺梗死等；②恶性肿瘤患者；③合并其他急重症，如急性脑卒中、心脏病、休克、脑梗死、肝肾疾病、急性冠状动脉综合征者；④近期接受免疫抑制剂治疗的 患者。

1.2 主要仪器与试剂

FGF-21 及MIP-2 酶联免疫吸附检测（ELISA）试剂盒（上海恒远生物科技有限公司），PFT System 肺功能仪、飞利浦彩色多普勒超声诊断仪（苏州Philips有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 组织标本采集取距病灶边缘＜1 cm 肺组织且经病理学检查证实为特发性肺纤维化为研究对象；取超过肺纤维化边缘＞2 cm 的肺旁组织为对照。于离体10 min 内迅速投入液氮中保存。

1.3.2 检测方法Western blotting 检测FGF-21、MIP-2 蛋白水平，取0.1 g 特发性肺纤维化组织及肺旁正常组织，匀浆后抽提总蛋白。用BCA 蛋白浓度试剂盒检测蛋白含量。取20 μg 蛋白行10% SDS-PAGE后转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入抗相应抗体后于4℃孵育过夜。使用TBST 洗膜3 次，加入Ⅱ抗余室温孵育1 h，使用TBST再次洗膜3 次，ECL 发光自显影。分别以FGF-21、MIP-2 蛋白条带密度与GAPDH 条带吸光度比值表示FGF-21、MIP-2 蛋白的相对表达量。

逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 的表达水平，采用Trizol 法抽提特发性肺纤维化组织及肺旁正常组织中的总RNA：取各标本组织50 mg，在组织标本中加入1 ml Trizol 研磨至均质，吸取匀浆液1.5 ml 至EP 管中，加入氯仿离心后取上清液，加入等量异丙嗪，离心后取沉淀物，75%乙醇洗涤后加入RNase-Free H2O2溶解RNA，适当稀释后用紫外分光光度计在260 和280 nm 波长处测定RNA 纯度，控制RNA A260/A280 纯度一致。使用PrimeScript ® RT Master 试剂盒，按照说明书进行操作，加样后行RT-PCR，使RNA 逆转录为cDNA。以cDNA 为模板，GAPDH 为内参，采用实时荧光定量聚合酶链反应，严格按照试剂盒说明书进行PCR反应。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验或方差分析；利用条件Logistic 回归分析特发性肺纤维化的相关因素，利用Cox 回归分析特发性肺纤维化患者临床预后的相关因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 特发性肺纤维化组织及肺旁正常组织FGF-21 和MIP-2 mRNA 及蛋白的表达

特发性肺纤维化组织中FGF-21 和MIP-2 mRNA及蛋白的表达差异有统计学意义（P＜0.05），特发性肺纤维化组织较肺旁正常组织升高。见表1 和图1、2。

2.2 特发性肺纤维化组织FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 的表达与临床病理特征的关系

FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 的表达水平与患者性别、年龄、吸烟、BMI 和病程无关（P＞0.05）。见表2。

2.3 特发性肺纤维化相关因素的条件Logisitic 回归分析

将特发性肺纤维化作为因变量（肺纤维化组织赋值=1；肺旁正常组织赋值=0），将FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA作为自变量，构建Logistic回归分析模型，结果表明，特发性肺纤维化的发生与FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 呈正相关（P＜0.05）。见表3。

表1 正常组织及特发性肺纤维化组织FGF-21、MIP-2 mRNA 和蛋白的表达 （n =80，±s）

表1 正常组织及特发性肺纤维化组织FGF-21、MIP-2 mRNA 和蛋白的表达 （n =80，±s）

组别 FGF-21 mRNA MIP-2 mRNA FGF-21 蛋白 MIP-2 蛋白特发性肺纤维化组织 3.06±0.46 23.48±1.44 2.78±0.53 18.36±1.21肺旁正常组织 2.10±0.35 16.20±1.27 2.42±0.49 13.85±1.33 t 值 14.855 33.913 4.461 22.435 P 值 0.001 0.001 0.001 0.001

图1 PCR 原始数据图

图2 FGF-21、MIP-2、GAPDH 蛋白表达

表2 FGF-21 mRNA 和MIP-2 mRNA 表达与临床病理特征的关系

续表2

2.4 特发性肺纤维化预后的Cox 回归分析

将患者的结局变量作为分类变量（生存赋值=1，死亡赋值=0），将患者的生存时间作为连续变量，将性别、年龄、BMI、吸烟史、病程、FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 作为自变量，构建Cox 回归分析模型，结果显示，FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 的高表达水平是影响特发性肺纤维化患者临床预后的独立危险因素，见表4。

表3 特发性肺纤维化相关因素的Logistic 回归分析参数

表4 特发性肺纤维化患者临床预后的Cox 回归分析参数

3 讨论

特发性肺纤维化是一种慢性纤维化肺疾病，并呈进行性进展。该病常见于中老年人，临床主要表现为咳嗽、呼吸困难、呼吸衰竭、低氧血症等，严重影响患者的生命质量和安全[9]。但目前关于特发性肺纤维化的病因尚未明确，给治疗带来极大限制，因而寻找特发性肺纤维化的病因从而对其进行早期预防、干预具有重要临床意义。

FGF-21 是成纤维细胞生长因子超家族中的一种，其通过辅因子β-Klotho 蛋白的作用与细胞表面的成纤维细胞生长因子受体结合，形成FGF-21-β-Klotho-FGFR 复合体而发挥生物学作用。FGF-21 功能较多，可参与机体多种物质代谢，如葡萄糖、脂肪等，其可降低血糖、血脂，改善胰岛素抵抗及胰岛细胞功能等[10]。相关研究表明，FGF-21 参与多种疾病的发生、发展。例如，糖尿病性大血管病变、糖尿病合并颈动脉斑块的患者血清FGF-21 水平升高[11]，发生FGF-21 抵抗。另外，研究发现[12-13]，FGF-21 还可通过激活Nrf2 而抑制NF-κB 信号通路，从而抑制巨噬细胞介导的体内炎症反应，其在关节炎的发生、发展中发挥重要作用。此外，FGF-21 还可通过抑制APAP 而抑制氧化应激反应、抑制IL-6、TNF-α、C 反应蛋白的表达，以及抑制血小板的聚集和活化等。但目前关于FGF-21 在特发性肺纤维化中是否起重要作用的研究甚少。本研究结果显示，特发性肺纤维化组织FGF-21 mRNA 及蛋白的表达水平较肺旁正常组织升高；FGF-21 mRNA 的表达水平与患者性别、年龄、吸烟、BMI 和病程无关；条件Logistic 回归分析模型结果表明，特发性肺纤维化的发生与FGF-21 mRNA 呈正相关；结果表明，FGF-21 参与特发性肺纤维化的发生及发展。本研究中Cox 回归分析结果显示，FGF-21 mRNA的高表达水平是影响特发性肺纤维化患者临床预后的独立因素，结果表明，FGF-21 与特发性肺纤维化的预后具有重要关系。相关研究发现，发生氧化损伤时可降低机体FGF-21 蛋白的表达量，FGF-21 蛋白与氧化应激具有相关性，使用FGF-21 蛋白可逆转小鼠的肺纤维化症状[15]。因此，对特发性肺纤维化患者可抑制机体FGF-21 mRNA 的表达水平从而进行早期治疗，从而 有助于改善预后。

MIP-2 蛋白是肺泡巨噬细胞分泌的蛋白产物，其具有特异性，专作用于中性粒细胞，可发挥趋化和激活作用[15]。在炎症早期，NF-κB 被激活并调节MIP-2基因的转录，机体分泌MIP-2 增加，特异性趋化中性粒细胞及巨噬细胞的重要因子。MIP-2 参与多种疾病，如脓毒症、盆腔炎、呼吸道疾病等。相关研究表明，当呼吸道受到刺激或损害时，如吸烟、污染、细菌或病毒等，巨噬细胞、中性粒细胞可快速合成并分泌大量MIP-2[16]。有研究表明[17]，MIP-2 蛋白可增加相关炎症因子的合成与分泌，诱导炎症因子发生浸润，从而增加血管通透性。据报道[18]，在博来霉素致肺纤维化的大鼠中，MIP-2 升高，而地塞米松可抑制MIP-2 的表达并降低炎症反应。但目前关于MIP-2 与人类特发性肺纤维化的发生及发展的研究甚少。本研究结果显示，特发性肺纤维化组织MIP-2 mRNA 的表达水平较肺旁正常组织升高；MIP-2 mRNA 的表达水平与患者性别、年龄、吸烟、BMI 和病程无关；Logistic 回归分析模型结果表明，特发性肺纤维化的发生与MIP-2 mRNA 呈正相关；结果表明，MIP-2 参与特发性肺纤维化的发生及发展。本研究中Cox 回归分析结果显示，MIP-2 mRNA 的高表达水平是影响特发性肺纤维化患者临床预后的独立因素，结果表明，MIP-2 与特发性肺纤维化的预后具有重要关系。因此，对疑似特发性肺纤维化患者，可检测MIP-2 mRNA 的表达水平从而进行诊断并早期干预。

综上所述，FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 的高表达水平是特发性肺纤维化发生的相关因素，并与临床预后相关。临床对于特发性肺纤维化患者可降低机体FGF-21 mRNA、MIP-2 mRNA 的表达水平，从而延长患者生存时间。