茶多酚对脂多糖诱导小鼠急性肾损伤的保护作用及机制

许明贤，唐瑞娣，张洁容，曹舒晴，秦理璐，肖嘉琪，王桂房

（广州医科大学 1.基础学院生理教研室，2.基础学院机能实验中心，广东 广州 511436）

脂多糖（Lipopolysaccharides, LPS）是革兰阴性细菌内毒素主要成分，也是革兰阴性细菌激发宿主免疫应答，导致机体损伤的重要因素。人体聚集的革兰阴性杆菌最丰富的部位是肠道。革兰阴性菌感染时，可导致肾脏缺血、肾灌注减少及肾功能的改变，因细胞损伤凋亡、氧化应激、线粒体功能障碍[4]和炎症反应等多种复杂的病理生理学机制导致急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）。LPS 不仅可直接或间接地造成肾脏细胞损伤[5-7]，而且其诱导的肾细胞坏死在重症肾炎的发展中起重要作用。茶多酚是从茶叶中提取出来的一种含多酚类化合物的混合物，包含多个酚羟基结构，具有强大的抗氧化作用。多项研究表明，茶多酚还具有抗衰老、保护心脑血管、降血脂等作用[8-9]。本研究拟从氧化应激、炎症反应两方面探讨茶多酚对脂多糖诱导小鼠急性肾损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

无特定病原体（SPF）级KM 雄性小鼠，体重（35± 3）g，购自中山大学动物中心；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）测试盒、肌酐（Cr）测试盒、血尿素氮（BUN）测试盒及尿蛋白（Upro）定量测试盒均购自南京建成生物工程研究所，小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，LPS 购自合肥博美生物科技有限责任公司，茶多酚（纯度98.35%，食品级）购自陕西嘉禾生物科技股份有限公司。

1.2 动物模型制备

24 只KM 雄性小鼠随机分为假手术组、模型组和茶多酚治疗组（治疗组），每组8 只。采用腹腔注射LPS（10 mg/kg）的方法复制小鼠AKI 模型[1-2]，假手术组注射同样剂量生理盐水。治疗组于术前7 d 开始用茶多酚溶液灌胃（200 mg/kg，1 次/d）[3]，其他两组均用等量蒸馏水灌胃，1 次/d，持续8 d，正常饲食。

1.3 血尿生化指标、细胞因子检测和肾组织HE染色

眼球取血，分离血清测定BUN、血肌酐（Scr）、MDA、SOD 水平和GSH-Px 活性。留取模型复制后24 h 尿液，检测BUN、Upro 和尿肌酐（Ucr）的水平。取小鼠双侧肾脏，冰生理盐水洗去血液，用滤纸吸去表面水分，称重并计算小鼠肾脏系数（肾脏重量/ 小鼠体重×100%）。随后取部分肾脏，加入冰生理盐水，冰上匀浆，低温离心并取上清液检测TNF-α 和IL-1β 的浓度，余下部分置于Bouin 液防腐，用苏木精-伊红（HE）染色，切片，光学显微镜（×400）下观察肾组织损伤情况。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 软件统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用单因素方差分析,进一步两两比较用Duncan's 新复极差法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠血清和尿液BUN、Cr，Upro 水平及肾脏系数比较

3 组小鼠Scr、血BUN、Ucr、Upro、尿BUN 及肾脏系数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组和治疗组小鼠Scr、血BUN、Ucr、Upro、尿BUN 水平及肾脏系数均提高（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组上述指标降低（P＜0.05）。见表1。

2.2 小鼠血清MDA、SOD 和GSH-Px 水平比较

3 组MDA、SOD 及GSH-Px 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组和治疗组小鼠血清MDA 水平提高，SOD 和GSH-Px 水平下降（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组MDA 水平降低，而SOD 和GSH-Px 水平提高（P＜0.05）。见表2。

2.3 小鼠肾脏组织中TNF-α 和IL-1β 水平比较

3 组IL-1β 和TNF-α 比较，差异有统计学意义 （P＜0.05）。与假手术组比较，模型组和治疗组小鼠肾组织IL-1β 和TNF-α 水平提高（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组IL-1β 和TNF-α 水平降低（P＜0.05）。见表3。

2.4 小鼠肾脏组织HE 染色病理结果

肾脏组织HE 染色切片显示，假手术组肾小球、肾曲管结构正常清楚，肾间质及肾小球无充血和炎症细胞浸润。模型组相对于假手术组肾小管上皮细胞出现变性坏死，肾小管出现蛋白管型，并明显扩张；肾间质充血水肿并有大量炎症细胞浸润，肾小球可见中性粒细胞浸润及纤维素渗出。与模型组比较，治疗组肾脏组织损伤情况明显缓解。见图1。

表1 3 组小鼠血清和尿液BUN、Cr、Upro 和肾脏系数比较 （n =8，±s）

表1 3 组小鼠血清和尿液BUN、Cr、Upro 和肾脏系数比较 （n =8，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别 Scr/（μmol/L） 血BUN/（mmol/L） Ucr/（μmol/L） Upro/（μmol/L） 尿BUN/（mmol/L） 肾脏系数/（g/kg）假手术组 15.12±1.83 5.38±0.43 1 758.93±262.14 1 144.38±132.54 261.04±49.31 1.15±0.08模型组 56.50±10.55① 49.38±8.63① 5 829.91±565.40① 2 755.83±257.18① 539.72±33.27① 1.58±0.07①治疗组 35.47±7.95①② 29.95±3.10①② 3 239.73±304.18①② 2 075.29±183.87①② 302.23±37.50①② 1.23±0.05①②F 值 57.758 138.361 211.884 133.651 114.551 96.733 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 3 组小鼠氧化应激指标比较 （n =8，±s）

表2 3 组小鼠氧化应激指标比较 （n =8，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别 MDA/（nmol/L） SOD/（u/ml） GSH-Px/（u/ml）假手术组 5.22±0.77 15.55±2.16 58.65±1.28模型组 10.97±1.92① 10.46±1.14① 34.20±4.62①治疗组 7.63±0.40①② 12.27±1.32①② 114.12±12.39①②F 值 45.356 18.217 199.670 P 值 0.000 0.000 0.000

表3 3 组小鼠肾脏组织炎症因子比较 （n =8，pg/ml，±s）

表3 3 组小鼠肾脏组织炎症因子比较 （n =8，pg/ml，±s）

注：①与假手术组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05。

组别 IL-1β TNF-α假手术组 33.49±2.30 32.59±1.11模型组 64.24±0.13① 55.12±1.06①治疗组 56.05±0.38①② 49.49±1.36①②F 值 556.305 392.132 P 值 0.000 0.000

图1 小鼠肾脏组织病理切片（HE 染色×400）

3 讨论

LPS 进入机体诱发脓毒血症可引起全身多器官衰竭[5-6]，其中AKI 是脓毒血症中常见的致死原因[10]。研究表明，内毒素血症时诱导白细胞（主要是中性粒细胞）表面黏附分子发生改变，被激活后产生大量超氧化物和一系列炎症因子，形成级联瀑布式炎症反应，主要通过自由基和炎症因子作用引起局部组织细胞损伤[11-12]。同时氧化应激改变线粒体膜的通透性，从而进一步减少线粒体内的氧化型辅酶（NAD）加重氧化应激作用。根据DENG 等[13]的研究，实验中脓毒血症AKI 是潜在、可逆的发病过程，即早期抗炎和/或抗氧化治疗可以改善肾功能。

本研究发现，腹腔注射LPS 可导致小鼠肾功能下降、肾脏系数增加、肾组织损伤；连续茶多酚灌胃给药能改善肾功能，表现为血清BUN、Scr 水平下降，24 h 尿液BUN、Ucr 和Upro 水平下降，这些结果提示口服茶多酚可改善LPS 引起的肾功能损伤。

文献表明LPS 引起AKI 的机制与自由基的产生、脂质过氧化和炎症反应有重要关系[2，14]。MDA 是体内脂质过氧化的重要产物，可间接反映脂质过氧化程度，是评价氧化应激水平的重要指标。而SOD 可以清除体内的氧自由基，可以缓解组织由于自由基导致的损伤，同时超氧化物可以影响SOD 的活性，组织损伤严重时SOD 功能减退甚至失活。GSH-Px 是机体重要的抗氧化剂和自由基清除剂，通过与自由基、重金属等结合，从而把机体内有害的毒物转化为无害的物质，排出体外。因此，SOD、GSH-Px 在机体的抗氧化作用方面有重大意义。本研究结果提示，治疗组小鼠血清MDA 水平比模型组降低，血清中SOD 和GSH-Px水平提高，并且治疗组血清GSH-Px 水平高于假手术组。提示茶多酚有上调正常机体GSH-Px 表达水平的作用，从而减少自由基的生成。治疗组小鼠血清SOD的水平高于模型组，说明茶多酚可以使小鼠血清SOD水平提高，从而缓解自由基对机体肾脏组织损伤起到保护作用。

IL-2 和TNF-α 均为组织细胞释放的细胞因子。IL-2 是由T 细胞分泌参与T 细胞分化和增殖的细胞因子，同时参加炎症反应和自身免疫反应。TNF-α 主要启动炎症相关反应通路，如NF-κB 信号通路。正常情况下，细胞因子组成动态平衡的网络。内毒素可以作用于机体单核-巨噬细胞系统，诱导组织细胞产生一系列炎症因子，如前列腺素、IL-1、TNF-α 等，各种炎症因子参与一系列细胞因子网络反应，其中最重要的炎症通路是Toll 样受体4（TLR4）通路[13]，炎症 因子相互促进和诱发级联炎症反应。焦路阳等[15]研究报道急性百草枯中毒大鼠的血清IL-2、IL-6 和TNF-α 水平升高，以上炎症因子参与肾损伤的发生、发展过程。血清IL-2 和TNF-α 水平除用作反映机体炎症反应的指标外，还可作为评价本实验中肾损伤治疗效果的依据。治疗组肾脏组织中IL-2 和TNF-α水平相比假手术组升高，同模型组比较降低，提示本研究中茶多酚可缓解LPS 导致的小鼠AKI。此外，茶多酚治疗组的肾脏系数较模型组降低，肾脏HE 染色病理切片提示治疗组肾小管肿胀和间质水肿，但出血不明显，炎症细胞浸润现象程度也较模型组轻。

本实验中模型组相比假手术组BUN、Cr 和Upro水平升高，血清中MDA 水平上调，血清中SOD 和GSH-Px 水平降低，肾脏组织中IL-2 和TNF-α 水平均高于假手术组，说明在LPS 作用下成功诱导小鼠AKI模型。治疗组相比模型组肾功能改善，其作用机制与茶多酚的抗氧化应激作用和抗炎症反应有关，与徐文萍等的研究结果[16]一致。我国茶叶资源丰富，茶多酚的来源广泛，且毒副作用小，但在临床应用并不普遍。沈海涛等[3]的研究表明，茶多酚干预对百草枯大鼠肾脏有保护作用，且该作用在一定浓度范围内呈现剂量相关性。目前，国内研究已经证明茶多酚对多种毒物因氧化应激等机制造成的急性损伤有保护作用[17]，根据欧春丽等[18]的研究，茶多酚口服给药的安全性较好，小鼠的给药量达到108 g/（kg·d）灌胃第7 天时仍未出现明显急性毒性反应。本实验在给药期间小鼠无明显不良反应，治疗组小鼠相比模型组小鼠肾功能改善。

综上所述，茶多酚预处理对LPS 诱导的脓毒症小鼠AKI 有一定保护作用，其机制与茶多酚对抗氧化应激和抑制肾脏炎症反应有关。