一种高抗性产海藻糖酿酒酵母菌株的开发*

孙同清

（青岛啤酒（三水）有限公司，广东佛山 528100）

酵母菌（Saccharomyces cerevisiae） 是自然界分布甚广的一类真菌，为发酵工业生产的重要微生物，由于其具有生长迅速易培养的特点，在科学研究和生产实践中有着广泛的应用。

海藻糖是一种非还原性二糖，广泛存在于海藻、酵母、霉菌和食用菌等生物体内，是一种贮藏性碳水化合物。海藻糖具有保护细胞核等物质，在脱水、干燥、高温、冷冻及高渗透压等不良环境条件下活性免遭破坏的功能，是国际上最近开发的主要低聚糖之一。海藻糖在微生物细胞中的合成非常强烈。它的积累一般和生长速度的降低有关，特别是在分化过程和营养不足时，可由酶直接催化合成海藻糖。

若将酵母细胞置于饥饿条件下，其产海藻糖的量也会大大提高，当海藻糖含量越高时，酵母细胞对干燥的抵抗力也明显增强。在酵母的整个生命周期，海藻糖在再生阶段积累，在出芽期间流动，生长速度降低促进海藻糖的积累。

本文以高抗性产海藻糖酿酒酵母菌株ZGJ-4 为研究对象，从菌学特征、抗性研究、酵母菌ZGJ-4发酵制备海藻糖的工艺研究等三方面对ZGJ-4 的开发进行了探讨，全面分析ZGJ-4 的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂

葡萄糖，分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司；琼脂，生化试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司；乙醇，分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂；磷酸二氢钾，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；磷酸氢二钾，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；氯化钾，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；海藻糖，色谱纯级标准品，SIGMA 公司。

1.1.2 试验仪器

SYQ-DSX-280B，手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海申安；AR1140，电子精密天平，上海奥豪斯；THZ-C，恒温振荡器，江苏太仓；SW-CJ-2D，双人单面净化工作台，苏州净化；PYX-190S-A，恒温培养箱，广东科力；UPT-I-10L，优谱UPT 系列超纯水器，上海优谱；DNP-916BS-III，电热恒温培养箱，上海新苗；LC-2010HT，高效液相分析仪，日本岛津SHIMADZU。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基配制

斜面培养基与平板培养基（g/L）：豆芽汁100 mL（豆芽除头除尾加热30 min，用4～6 层纱布过滤），加10 g 葡萄糖，4 g 琼脂制成培养基，在0.1 MPa、121 ℃条件下灭菌20 min。

液体培养基与种子培养基（g/L）：豆芽汁100 mL（豆芽除头除尾加热30 min，用4～6 层纱布过滤），加10 g 葡萄糖制成液体培养基，在0.1 MPa、121 ℃条件下灭菌20 min。

发酵培养基（g/L）：酵母膏45 g，蛋白胨15 g，（NH4）2SO415 g，葡萄糖60 g，制成3 L 发酵培养基，在0.1 MPa，121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2.2 产海藻糖酵母菌ZGJ-4 的菌学特性

将野生皱皮柑剥皮，榨汁，装入瓶中。将自行发酵带果香的皱皮柑汁液，吸取0.2 mL均匀涂布于装有已灭菌斜面培养基的培养皿上，28 ℃恒温箱培养2 d 后，观察菌落特征，其菌落生长良好，具有明显酵母菌菌落特征，经进一步纯化培养，选择果香不太明显、菌落形成较小、乳白色的菌体，在无菌操作台上划线进一步接种于新鲜斜面培养基上，培养温度为36 ℃，培养3 d。待长出菌落后进一步采用分区划线法进行纯化，重复以上步骤3～5 次，直至分离出纯单菌株。采用镜检和基因测序技术对菌学特征进行描述。

1.2.3 产海藻糖酵母菌ZGJ-4 的抗性研究

1.2.3.1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精测试

采用平板培养基配方，在40 ℃时分别于培养基中加入2.0 mL、2.4 mL、2.8 mL、3.2 mL、3.6 mL、4.0 mL 无水乙醇，pH 自然，倒平板凝固，涂布0.2 mL 菌液，于28 ℃恒温培养7d，考察不同添加量的无水乙醇对酵母菌菌落生长状况的影响。

1.2.3.2 酵母菌ZGJ-4 的抗渗透压测试

采用液体培养基配方，加入不同量的KCL 使其在培养基中的浓度分别为1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L、3.0 mol/L，pH 自然，装液量50 mL/250 mL 锥形瓶，接种量为2%，于28 ℃，160 r/min，培养5 d，考察不同渗透压下酵母菌菌落生长状况。

1.2.3.3 酵母菌ZGJ-4 的抗饥饿时间测试

采用液体培养基配方，装液量50 mL/250 mL锥形瓶，接种量为2%，接种菌株均经过不同天数的饥饿处理，在室温25 ℃条件下饥饿天数为3 d、5 d、7 d、9 d 和11 d，再置于28 ℃，160 r/min，培养5 d，考察不同饥饿程度对酵母菌菌落生长状况的影响。

1.2.3.4 酵母菌ZGJ-4 的抗高温测试

采用斜面培养基，pH 自然，倒平板凝固，涂布0.2 mL 菌液，分别于20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃温度下恒温培养7 d，考察高温对酵母菌菌落生长状况的影响。

1.2.3.5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖测试

采用液体培养基配方，培养基中分别按比例5%、10%、15%、20%、25%、30%添加蔗糖，pH自然，装液量50 mL/250 mL 锥形瓶，接种量为2%。在28 ℃、160 r/min 条件下培养5 d，考察不同含糖量对酵母菌菌落生长状况的影响。

1.2.3.6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 测试

采用液体培养基配方，加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾调节培养液pH，使pH 分别为3.0、4.0、5.0、6.0 和7.0，装液量50 mL/250 mL 锥形瓶，接种量为2%，在28 ℃，160 r/min 条件下培养5 d，考察不同pH 对酵母菌菌落生长状况的影响。

1.2.4 酵母菌ZGJ-4 制备海藻糖工艺研究

1.2.4.1 工艺流程

斜面菌种→菌种扩培→发酵培养→收集菌体→饥饿处理→干燥脱水→干燥粉碎→膜过滤→浓缩结晶

1.2.4.2 操作过程

a） 接种。将含有酵母菌ZGJ-4 的斜面菌苔，刮取2 环菌体接种到内装10 mL 液体培养基的三角瓶中，温度32 ℃、220 r/min 条件下培养2 d。

b） 菌种扩培。将培养基中长势良好的酵母菌ZGJ-4 菌液，接种到盛有100 mL 种子培养基的1 L摇瓶中，发酵温度32 ℃，220 r/min 条件下培养2 d。

c） 发酵培养。将扩培好的酵母菌ZGJ-4 菌液，按8%的比例接种到盛有3 L 发酵培养基的10 L 发酵罐中，发酵温度35 ℃，发酵4 d。

d） 收集菌体，让菌体饥饿处理3 h，再用离心机脱水并烘干，用粉碎机粉碎。

e） 用去离子水溶解，均匀搅拌1 h，再用超滤膜过滤。

f） 浓缩结晶:将滤液在一定条件下浓缩，得海藻糖产品。

g） 检测：经HPLC 检测，检测方法参照文献[9]、[10]。

2 结果与分析

2.1 产海藻糖酵母菌ZGJ-4 的菌学特性

经培养，菌株在高温条件下，斜面培养基上生长的菌落呈乳白色（图1），酵母菌长势良好。挑取酵母菌单菌体做装片，在显微镜下观察酵母菌的个体形态（图2）。

形态特征：在斜面培养基上，菌落大小为6 mm～8 mm，正面圆形，侧面为低凸面，边缘整齐，乳白色，湿润，较光滑，黏稠，易用接种环挑取，有微弱的果香味、酸味产生。在液体培养基中静止培养时，有菌环，沉淀，菌液混浊，产气明显。在普通光学显微镜下观察，细胞个体呈球形或椭圆形，直径约为（5.2～12.7） μm。单个或成双，芽殖。

图1 斜面菌苔

图2 个体形态

生理生化特征：ZGJ-4 与GenBank 上其他酵母菌的18S rRNA 和26S rRNA 核苷酸序列的一致性分别为99%和97%，该菌株属于酿酒酵母。在碳源的氧化测定中，当以D-海藻糖为唯一碳源时，GZJ-4 具有强氧化能力，测定结果呈阳性，菌株生长能力好，代谢产物积累显著；当以蔗糖、α-D-葡萄糖、麦芽糖、D-棉子糖、龙胆二糖等为唯一碳源时，GZJ-4 氧化能力呈弱阳性，菌株生长能力较弱，代谢产物积累不显著。在碳源利用上，ZGJ-4 可以有效利用D-海藻糖，其次利用龙胆二糖、麦芽糖、蔗糖、α-D-葡萄糖，不能利用D-蜜二糖、纤维二糖、D-半乳糖和糊精等。

2.2 产海藻糖酵母菌ZGJ-4 的抗性研究

2.2.1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精测试结果

酵母菌ZGJ-4 的抗酒精测试结果见表1。

表1 酵母菌ZGJ-4 的抗酒精测试结果

由表1 可知，当酒精添加量逐渐增加时，酵母菌的生长与繁殖受到的抑制程度就越强烈，其菌落表现出的性状就越不正常。当酒精添加量超出2.8 mL，酵母菌生长开始受到限制，酒精含量越高菌种越易出现自溶退化的现象。

2.2.2 酵母菌ZGJ-4 的抗渗透压测试结果

酵母菌ZGJ-4 的抗渗透压测试结果见表2。

表2 酵母菌ZGJ-4 的抗渗透压测试结果

由表2 可知，酵母菌的生长受培养液渗透压的影响较大；当培养液中的KCl 浓度超过2.0 mol/L时，此时培养液的渗透压已经超出了酵母菌所能承受的极限，在此环境下酵母菌无法进行正常生长与繁殖，所以培养液中酵母菌体含量很低，培养液呈现清亮透明状。

2.2.3 酵母菌ZGJ-4 的抗饥饿测试结果

酵母菌ZGJ-4 的抗饥饿测试结果见表3。

表3 酵母菌ZGJ-4 的抗饥饿测试结果

由表3 可知，饥饿7 d 内对酵母菌的正常生长、繁殖影响不大。当酵母菌由饥饿环境转移到培养基中时很快就可以进行正常的生长繁殖。由此可知，当酵母菌饥饿时有可能进入了休眠状态，以芽孢的形态帮助度过饥饿时间，当酵母菌被接种到新鲜的培养基中时很快就从休眠状态苏醒进行正常的生长繁殖。

2.2.4 酵母菌ZGJ-4 的抗高温测试结果

普通酵母菌的最适生长温度为26 ℃～28 ℃，耐受温度为38 ℃，高温会大大抑制酵母菌的生长，一般情况下当温度达到一定程度时酵母菌的生长会受到强烈抑制甚至停止生长，就算有所生长所表达出来的性状也很糟糕，这个温度即酵母菌的耐受极限温度。

酵母菌ZGJ-4 的抗高温测试结果见表4。

表4 酵母菌ZGJ-4 的抗高温测试结果

由表4 可知，酵母菌ZGJ-4 在28 ℃～32 ℃下生长良好，且在40 ℃高温条件下，该菌仍能生长，其形态结构、生理特征等未发生变化，研究表明酵母菌ZGJ-4 具有一定的抗高温能力。

2.2.5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖测试结果

酵母菌ZGJ-4 的抗高糖测试结果见表5。

表5 酵母菌ZGJ-4 的抗高糖测试结果

由表5 可知，培养基中含糖量对酵母菌的生长繁殖无明显影响，可能是因为在接种后一段时间内酵母菌进行生长繁殖消耗了大量糖分，而维持菌体生长繁殖代谢则需要不断补充蔗糖等碳源物质的供给。

2.2.6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 测试结果

酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 测试结果见表6。

表6 酵母菌ZGJ-4 的抗低pH 测试结果

由表6 可知，酵母菌在pH 为3.0～7.0 这个范围内，具有较好的生长状况，但是在pH 为3.0～5.0时，酵母菌具有较强的生长和繁殖能力，所以对应的培养液内其浑浊程度最高，在这几组试验中，当pH 为4.0 时，酵母菌的代谢是最活跃的，所以此条件下产生的发酵液具有浓郁酒香味。

2.3 酵母菌ZGJ-4 发酵制备海藻糖的试验结果

8%酵母悬液→过80 目筛2 次→加5%酒石酸，沉降30 min→4 ℃，3 600 r/min 离心10 min→弃去上清液→HPLC 检测。检测结果为：每100 g 干重细胞含有35 g 海藻糖，海藻糖得率＞80%。

3 结论

综上所述，酵母菌ZGJ-4 在高温、高糖、低pH 和饥饿等条件下均能正常生长，未发生菌株形态变异、菌株性能退化等现象，说明酵母菌ZGJ-4具备抗高温、抗饥饿等显著性特征，所以酵母菌ZGJ-4 可用来制备海藻糖。同时，由于ZGJ-4 来自汁液偏酸（pH4.5） 的皱皮柑，对高酸性环境有很强忍耐力，因此还可应用于果汁尤其是高酸性果汁如山葡萄汁、猕猴桃汁和山楂汁等的发酵，酵母菌ZGJ-4 有很大的开发前景。