骨髓间充质干细胞对树脂毒素介导的小鼠神经病理性疼痛模型镇痛作用及其机制*

李楠琦 徐雯雯 汤 洋 安 珂 万 丽

（1 中山大学附属第一医院麻醉科，广州 510080；2 广州医科大学附属第二医院疼痛科，广州510260）

神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 为外周或中枢神经系统结构损伤或者功能紊乱所引起的疼痛。临床上大多数神经病理性疼痛缺乏有效治疗方法，病人长期疼痛状态导致机体内环境紊乱、精神抑郁、甚至产生自杀的行为。胶质细胞是中枢神经系统内的重要支持细胞，近年来，大量的实验证据证明胶质细胞的活化在慢性疼痛的产生及痛觉中枢敏化中起重要作用。干预、逆转痛觉超敏状态，尤其是中枢水平的痛觉敏化，探究难治性神经病理性疼痛新的治疗方法是目前疼痛转化研究急待解决的问题[1]。骨髓间充质干细胞 (bone mesenchymal stem cells, BMSC)，为骨髓分离出的一类具有多向分化潜能的干细胞[2]，近年来干细胞治疗也成为国家重点支持的治疗技术与研究方向。目前较多基础研究焦点关注原位移植BMSC 对损伤的修复作用[3]，但其通过静脉注射发挥免疫调控及治疗神经病理性疼痛的机制仍待进一步探究。本研究通过树脂毒素 (resniferatoxin, RTX) 介导的新型神经病理性疼痛小鼠模型，证实了小胶质细胞参与疼痛中枢敏化的形成，并首次发现了静脉注射BMSC 可抑制小胶质细胞活化，BMSC 可通过改善脊髓背角树突棘的形态转化改善痛觉过敏的机制，为临床神经病理性疼痛提供更为理想的治疗方法。

方 法

1. 实验动物

健康雄性C57/BL6 小鼠36 只，6～8 周龄，质量22～25 g，均为SPF级，购自广东省实验动物中心。实验过程中对动物处置参照国家科学技术部2006发布的《关于善待动物的指导性意见》的相关要求[4]。

2. 主要试剂及仪器

vonFrey 纤毛仪购自美国Stoelin 公司，C57/BL6来源的GFP-BMSC 购自Cyagen Biosciences 广州公司；DMEM 低糖培养基、胎牛血清Fetal Bovine Serum (FBS)、0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜购自Gibco 美国公司；CD11b 兔抗小鼠抗体、MAPK p38 鼠单克隆抗体，Alex488 羊抗兔，Cy3 羊抗鼠二抗购自Abcam 公司。HRP 山羊抗兔二抗购自武汉Proteintech 公 司；FD Rapid GolgiStainTM Kit FD 快速高尔基染色试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司；Western blot 电泳、转膜仪购自Bio-Rad 公司，荧光倒置显微镜购自日本Leica 公司。

3. 动物模型的建立及分组

恒温清洁环境，光照12 h，湿度50%，予充足饮水及食物，每3 天更换垫料，饲养1 周后随机分为3 组，每组12 只：①溶剂对照组（Control 组）：一次性腹腔注射200 μl 溶解树脂毒素所用溶剂10%酒精10%吐温80；②RTX 神经痛组（RTX 组）：腹腔注射树脂毒素100 μg/kg，溶解于10%酒精加10%吐温80 溶液中，即每只造模剂量为4 μg。注射RTX 后第5 天注射200 μl PBS；③骨髓间充质干细胞移植组（BMSC 组）：RTX 神经痛建立后5 天，每只小鼠单次尾静脉输注包含骨髓间充质干细胞1×106个的200 μl 细胞悬液。每组小鼠行为学取5只进行作图统计。细胞移植剂量的选取根据为文献[5]以及预实验。小鼠尾静脉注射使用1 ml 刻度胰岛素注射针。各组小鼠在手术后第30 天统一处理、取材，并进行各指标的检测。

4. 行为学测试

机械痛阈 (mechanical withdrawl threshold, MWT)测试时间固定于10:00～12:00 进行，测试前30 min将小鼠置于玻璃箱中适应环境。采用vonFrey filaments测试，使用0.07 g～2 g 范围的纤维丝对小鼠右后足底进行MWT 测定，从0.07 g 纤维丝开始，刺激小鼠右后足底使纤毛稍弯曲呈S 形，持续时间≤5 s，小鼠出现舔足或足缩回的数值记为阳性反应。若5 次测定中阳性反应不足3 次则给予相邻大一级强度纤维丝的刺激[6]。两次刺激之间至少间隔15 s。将出现3 次以上阳性反应的最小纤维强度定为小鼠的MWT。每只小鼠测试5 次取MWT 平均值，每组统计5只小鼠。于RTX注射前1天测试基线值作自身对照，以及注射RTX 注射后1、5、10、15、20、25、30 天测试小鼠右足底对机械刺激的反应。Hargreaves 热痛阈 (thermal withdrawal latency, TWL) 与MWT 测试间隔1 h，小鼠置于Hargreaves 热痛仪透明玻璃板上，使用红外光斑照射右足，记录出现缩足反应时间，cut-off 时间设置为20 s 避免小鼠足底损伤。

5. GFP-骨髓间充质干细胞培养、扩增

取内含1×106BMSC 的冻存细胞复苏，接种于T25 培养瓶中，于37 ℃，体积分数5%CO2恒温培养箱中培养。使用含体积分数10% 胎牛血清的L-DMEM完全培养基进行细胞培养，次日更换培养基。2 天后细胞铺满瓶底约90%，加入0.25%胰酶2 ml 消化2～3 min，800 rpm，离心半径12 cm，离心5 min，按1:2 比例传代。细胞传至第8 代后用胰酶消化后离心，细胞计数板计数后取1×106BMSCs 重悬于200 μl PBS 中，于RTX 注射第5 天，用1 ml 胰岛素注射器给小鼠尾静脉注射细胞，RTX 模型组注射200 μl 0.1 M PBS。

6. 组织切片与染色

RTX 模型建立30 天后，每组小鼠于氯胺酮联合咪达唑仑深麻醉下，开胸暴露心脏，以0.1 M PBS 从左心灌流冲净血液后以4%多聚甲醛灌注固定，取腰段L2-L5脊髓组织，每组6 只，4%多聚甲醛后固定48 h，30%蔗糖溶液脱水沉底后，以OCT包埋于冰冻切片机作25 μm 连续冠状切片，进行免疫荧光染色观察。主要观察指标：观察3 组小鼠脊髓背角CD11b 标记的小胶质细胞形态及激活情况，GFP 染色观察BMSC 归巢情况。免疫荧光染色步骤：冰冻切片用0.1 M PBS 振荡清洗后加入3%山羊血清和0.3% Triton100X 的封闭液室温封闭2 h，加入一抗GFP (1:400)，CD11b (1:400)， p38 MAPK (1:200) 后4℃孵育过夜，吸净一抗后加入0.1 M PBS 清洗10 min×3 次，滴加荧光二抗工作液Alex488 (1:600)，Cy3 (1:1000)室温孵育2 h，0.1 M PBS 振荡冲清洗10 min×3 次，50%甘油封片，荧光显微镜下观察，激发波长为 550/565 nm 的Cy3 呈红色荧光表示，激发波长为488 nm 的Alex488 荧光显示为绿色，两受体共存表达处显示黄色荧光。

7. 免疫印迹检测小鼠腰段脊髓p38 蛋白的表达情况

RTX 模型建立30 天后，使用RIPA 蛋白提取液提取3 组小鼠L2-L5脊髓总蛋白，每组3 只。取出小鼠脊髓后以液氮速冻，然后在冰上使用研磨器及超声破碎组织，使用二喹啉酸 (bicinchoninic acid, BCA) 蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量。各组取30 μg 等量总蛋白在12% SDS-PAGE 上电泳（电压 80 V 20 min，120 V 1 h），之后转移到PVDF 膜上，300 mA 转模2 h。5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，一抗分别为GAPDH (1:10 000)， p38 MAPK (1:2000) 用辣根过氧化物酶 (HRP) 共轭的二抗室温孵育2 h，ECL 显影剂显影曝光。

8.高尔基染色

RTX 模型建立30 天后，每组小鼠在氯胺酮混合咪达唑仑麻醉液（100 mg/kg 氯胺酮 + 50 mg/kg咪达唑仑）深麻醉下处死小鼠后取出腰段脊髓，每组取材3 只。用蒸馏水冲净表面血液，在冰冻震荡切片机上将脊髓切成10 mm 的小块，根据Ramón Moliner, Glaser 和Van der Loos 所阐述的方法原理设计的FD Rapid GolgiStainTM Kit（FD 快速高尔基染色试剂盒）操作指导进行染色，统计每组小鼠脊髓背角浅层的至少三个独立神经元的完整树突上蘑菇形态树突棘密度。

9. 统计学分析

数据采集、统计及绘图分别使用 Excel、SPSS和Graphpad Prism 7.0 软件进行；行为学测试结果用均数±标准误(±SEM)表示。对于各组行为学痛阈值和免疫荧光阳性细胞数、免疫印迹灰度值比较采用单因素重复测量方差分析(One-way Repeated measurement ANOVA)并对同一时间点进 行组间比较，P＜ 0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1. GFP-BMSC 的培养纯化

培养纯化的第8 代骨髓间充质干细胞聚集度80%，1×106密度，在倒置像差显微镜下，呈簇状分布的梭形细胞聚集，GFP 标记的骨髓间充质干细胞在荧光显微镜下以488 nm光激发，细胞轮廓清晰，胞膜完整，细胞呈绿色（见图1A）。成脂诱导分化细胞贴壁 100%汇合后，加入间质干细胞成脂诱导液，成脂诱导 7 天后，细胞内有小脂滴出现，约13 天后脂滴数量增加并相互融合，细胞由长梭形变为圆形或多边形，油红O 染色显示有大量脂质沉淀（见图1B）。成骨诱导分化细胞贴壁约70%汇合后，加入间质干细胞成骨诱导液，诱导培养 15 天，胞质内充满颗粒，细胞呈集落样生长，细胞间可见钙质沉积，细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜素红染色呈红色结节（见图1C）。

2. 小鼠行为学分析

每组统计5 只小鼠，RTX 组MWT 在第5 天开始下降，第10 天与溶剂对照组有显著性差异 (P＜ 0.05)，且持续至RTX 给药后30 天。机械异常疼痛的改变提示RTX 诱导神经性疼痛模型建立成功（见图2A）。BMSC 组于RTX 注射后第10 天 MWT开始升高，至第25 天即BMSC 注射后20 天与RTX 组差异有显著性并持续至第30 天（P＜ 0.05，见图2B）。对照组小鼠与RTX 模型组小鼠TWL无显著性差异。

3. 荧光显微镜观察骨髓间充质干细胞标记情况

在RTX 模型第30 天，GFP 抗体染色的BMSC注射组小鼠腰段脊髓有绿色阳性细胞，细胞轮廓清晰，DAPI 染色叠片显示完整细胞核，且绿色荧光细胞大部分位于脊髓背角浅层，说明BMSC 定向归巢至小鼠脊髓背角（见图3）。

4. 对RTX 注射30 天后取材小鼠腰段脊髓进行荧光染色

在荧光显微镜下，小胶质细胞标记物CD11b显示红色荧光，小胶质细胞胞体明显，RTX 组较对照组CD11b 阳性明显增加（P＜ 0.05，见图4A 和图5），胞体肥大且突触增粗，呈阿米巴样活化形态， BMSC 治疗组CD11b 阳性表达较RTX 组显著减少，（P＜ 0.01，见图4D 和图5）；免疫印迹法检测3 组小鼠脊髓p38 MAPK 蛋白表达，RTX 组p38 MAPK蛋白表达明显上调，BMSC 注射组p38 MAPK表达下调（P＜ 0.05，见图4C、4D 和图5）；Western blot 结果显示RTX 组小鼠脊髓MAPK p38 MAPK 蛋白表达显著上调，而BMSC 移植组p38 MAPK 表达降低（见图4B 和4C）；小胶质细胞标记物CD11b与p38 MAPK 双染显示，在RTX 组p38 MAPK 与小胶质细胞有高度共定位，且RTX 组p38 MAPK与CD11b 双染阳性细胞与对照组相比增多，而在BMSC 组降低（见图5）。

5. 通过对腰段脊髓的高尔基染色观察每组小鼠突触形态学变化

RTX 组树突上头宽大于颈长的蘑菇形态样树突棘明显增多（见图6）。提示蘑菇形态树突棘的形成与疼痛密切相关[7]。统计每组小鼠脊髓背角神经元树突上蘑菇形态树突棘密度发现，与对照组相比RTX 组蘑菇型树突棘密度增加 (P＜ 0.05)， BMSC组蘑菇形态树突棘密度较RTX 组降低 (P＜ 0.05)。

讨 论

树脂毒素 (resiniferatoxin) 为辣椒素类似物的超强毒素轭合物、TRPV1 的激动剂、可导致无髓鞘的C 类神经纤维丧失，损伤有髓鞘Aδ 神经纤维，RTX 介导的疼痛模型可使大鼠机械痛觉过敏，并介导脊髓背角P 物质、CGRP 致痛神经肽的释放。临床上带状疱疹后神经痛的病人可呈现机械性感觉异常，大多数病人患区皮肤有痛觉超敏，而热敏感度减退。有研究指出带状疱疹病人外周神经的出芽变性，轴突缺失的病变与RTX 诱导的病理神经性疼痛模型病理表现相似[8]，其造成的机械痛觉超敏也较为贴近带状疱疹后神经痛的临床表现。因此，本研究选择RTX 模型小鼠作为研究对象，探究神经病理性疼痛状态下小胶质细胞的激活与痛敏的关系。本研究发现，RTX 处理小鼠出现显著的机械痛觉过敏现象，低机械痛阈可维持至第30 天，但注射RTX后热痛阈与对照组相比差异无显著性；同时脊髓小胶质细胞活性明显增强，说明小胶质细胞的激活与RTX 诱导的机械痛敏密切相关，与Lei 等[9]的研究结果一致。

作为神经系统的吞噬细胞，小胶质细胞在损伤后不仅介导炎性介质释放，且是造成神经鞘膜脱髓鞘病变的重要致病机制[10]。近年来的研究支持胶质细胞活化引起疼痛敏化的观点，当机体受到伤害性刺激时，小胶质细胞由静息表型转化为活化表型，激活一系列疼痛相关性通路以及炎症因子的释放，导致疼痛的中枢敏化和疼信号的级联放大[11,12]。有研究发现，小胶质细胞的拮抗剂虽然具有镇痛作用，如非选择性拮抗剂米诺环素 (minocyline) ，以及星状神经细胞拮抗剂氟代柠檬酸 (fluorocitra) ，但这两者的镇痛作用持续时间短暂，不仅对已经形成的迟发神经病理性疼痛作用有限，而且对损伤的神经鞘膜无修复作用，并具有一定程度的神经毒性[13]。因此早期修复损伤的轴突，控制小胶质细胞的激活，可能为修复损伤的神经鞘膜带来契机。

干细胞治疗是近年来用于神经病理性疼痛的新方法，既往研究焦点为干细胞通过分化为损伤部位同类细胞，替代正常细胞所需的功能达到修复作用，但最近的研究更关注于干细胞通过旁分泌机制调节机体免疫微环境的能力，其特有的免疫抑制及调节能力可促使M1 促炎型胶质细胞向M2 抗炎胶质细胞的转化[14]，从而抑制炎症反应及缓解疼痛。骨髓间充质干细胞作为研究较多的干细胞，其具有自我更新、多向分化潜能的特点。体外实验证明，骨髓间充质干细胞与小胶质细胞共培养，可以抑制TNF-α刺激后的小胶质细胞的激活[15]。但以往的细胞治疗研究侧重于原位移植骨髓间质干细胞于损伤部位，通过BMSC 自分泌的神经营养因子BDNF 产生神经修复作用[16]。而本研究则是通过全身作用的方式对BMSC在神经病理性疼痛的修复机制进行了探讨。

由于疼痛中枢敏化在外周神经及中枢水平广泛存在，因此本研究中采用尾静脉注射的方式，直接干预痛觉敏化的外周及中枢各阶段，观察BMSC的全身效应。根据前期预实验及相关文献，选择1×106作为小鼠细胞注射数量[5]。研究发现，尾静脉注射BMSC 后第10 天开始小鼠MWT 开始升高，但与RTX 组对比无显著性差异，直至BMSC 注射后第20 天，BMSC 组小鼠痛阈升高与对照组相比才具有显著差异，说明BMSC 在迁移至炎症部位前，在外周发挥有限的免疫调节作用。既往通过尾静脉注射直接观察到骨髓间充质干细胞归巢的研究并不多，有学者研究认为，经过尾静脉注射的干细胞大多嵌顿于肺，需耗时约2 周才能从肺迁移到损伤部位，且迁移至损伤部位的细胞数量少[17]。本研究中观察到，BMSC 经尾静脉注射后20 天，BMSC 对RTX处理小鼠产生明显的抗痛敏作用，提示经尾静脉注射，BMSC 可迁移至损伤部位，且可通过调节脊髓背角突触可塑性，对已经形成的慢性神经病理性疼痛发挥镇痛作用。此外，相较于原位移植，静脉注射干细胞侵入性损伤更小，操作较为简便。虽然本研究对细胞迁移现象有所观察，但对于促进这种现象发生涉及的趋化因子及迁移到脊髓的干细胞的转归还需更长期的研究和探讨。

慢性疼痛中枢敏化的最终结果是伤害神经信号的不断上传导致中枢水平突触可塑性变化。树突棘是微米级的树突突起，可以调节突触传递的功效。树突棘可分为头宽大于颈长的蘑菇型树突和头宽小于颈长的细长型树突，疼痛的形成与蘑菇型树突棘密度增加密切相关，蘑菇型树突棘密度可以作为新的协助支慢性疼痛确诊的生物标记物之一[18,19]。本研究中高尔基染色结果显示，RTX 小鼠脊髓背角神经元树突棘发生了形态学变化，RTX 组小鼠蘑菇型树突棘密度增加，而BMSC 治疗后，蘑菇型树突棘密度降低（见图6）。本研究结果证实了蘑菇型树突棘与神经病理性疼痛的相关性，BMSC 可以逆转慢性疼痛状态下已形成的树突棘形态改变，对迟发性及慢性神经病理性疼痛产生治疗作用。

已有的研究提示，胶质细胞活化后，首先激活丝裂酶原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) 典型的p38 通路，继而启动下游炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的释放，炎性因子更进一步促进MAPK 信号的激活，进而引发炎症级联反应，导致损伤及修复性改变[11]。本研究中注射RTX后不仅RTX 处理小鼠呈现显著的痛觉过敏行为，且脊髓背角的小胶质细胞标志物CD11b 及p38 MAPK表达显著增加，说明p38 MAPK 通路介导了小胶质细胞激活后的炎症损伤反应。而BMSC 处理后显著干预了脊髓p38 MAPK 蛋白表达水平，表明BMSC可能通过干预p38 MAPK 通路的免疫调节能力发挥镇痛作用。

综上所述，小胶质细胞的活化及p38 MAPK 参与了小鼠RTX 介导的神经病理性疼痛的形成，通过静脉注射骨髓间充质干细胞，可显著改善RTX 小鼠的机械痛敏，骨髓间充质干细胞可能是通过迁移至脊髓背角抑制小胶质细胞活化、p38 MAPK 表达、改善树突棘可塑性改变而达到镇痛作用。本研究结果为干细胞应用于临床难治性神经病理性疼痛提供了理论依据。