触液核NGF/ERK 信号通路参与CCI 大鼠神经病理性疼痛*

李光玲 张励才

（1 江南大学附属医院 无锡市第四人民医院麻醉科，无锡214000；2 江苏省麻醉学重点实验室 徐州医科大学，徐州221002）

神经病理性疼痛是由外周或中枢神经系统的直接损伤引起的慢性疼痛，以痛觉过敏、痛觉超敏和自发性疼痛为特点，给病人带来极大痛苦，严重影响人类健康[1]。目前对神经病理性疼痛的治疗主要采用非甾体消炎镇痛药、阿片类药物及抗抑郁药和抗惊厥药等治疗，但由于其具体的机制仍然不明，药物治疗效果不佳[2]。所以进一步明确神经病理性疼痛的发病机制对于临床治疗有重要意义。近年来研究发现触液核 (the cerebrospinal fluid-contacting nucleus, CSF-CN) 参与了神经病理性疼痛的发生和发展，进一步明确其具体分子机制，将为神经病理性疼痛的治疗提供新的方法。

在与疼痛相关的一些脑区中，CSF-CN 是本实验室发现的一个与疼痛信号调节通路密切相关的脑区。触液核由一类特殊的神经元组成。本实验室利用霍乱毒素亚单位B-辣根过氧化物酶复合物 (CB-HRP) 逆行示踪成功标记发现其主要由胞体位于中脑导水管腹侧面的脑实质内，长突起伸入脑脊液的神经元组成，该神经元被称为“远位触液神经元”。触液核可能在脑-脑脊液的信息传递、 物质交换或功能调控中起重要作用[3,4]。我们之前的研究发现CSF-CN在疼痛的发生及发展中起着重要作用。触液核中的ASIC3 和P 物质参与了炎性痛[5,6]。触液核中的Wnt5a在坐骨神经慢性压迫性损伤 (chronic constriction injury, CCI) 引起的神经病理性疼痛的模型中上调[7]。

神经生长因子 (nerve growth factor, NGF) 是最早发现的神经营养因子家族成员，有促进交感和感觉神经元成活分化和成熟的作用[8]。NGF 已经被发现在急性痛和慢性痛的产生和痛觉过敏中起着非常重要的作用。在大量的动物炎性痛模型中，NGF 的表达明显上调[9,10]。全身应用NGF 抗体可以减轻CFA 引起的痛觉过敏[11]。在小鼠骨癌痛模型中，早期应用NGF 抗体可以减少骨癌引起的骨质破坏并且可以减轻骨癌痛[12]。在神经病理性疼痛模型中，CCI 手术后NGF 在背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG) 及脊髓背角上调[13]。抗NGF 抗体全身用药可以减轻神经病理性痛觉过敏和异常性疼痛[14]。这些研究都证明了NGF 参与了疼痛的调节，但是其具体机制仍然不明确。NGF 与其受体TrkA 结合后主要通过激活细胞分裂素活化蛋白激酶/细胞外调节激酶 (MEK/ERK)信号途径发挥其作用。但是其在神经病理性疼痛情况下具体通过何种胞内分子信号通路发挥作用仍不明确。目前关于NGF 在神经病理性疼痛中的作用研究主要集中于DRG 和脊髓水平，脊髓上水平的研究很少。本研究的目的是观察在大鼠CCI 模型下触液核NGF 的表达情况，明确触液核NGF 是否参与了神经病理性疼痛及NGF 抗体是否可以通过抑制NGF/ERK 信号通路发挥其镇痛作用，有利于从高位中枢水平发现NGF 参与疼痛的分子机制。

方 法

1.试剂及器材

CB-HRP（Sigma,美国），山羊源CB一抗（Sigma,美国），兔源 NGF一抗（Abcam,美国），兔源p-ERK1/2一抗，兔源ERK1/2一抗（Abcam,美国），驴抗兔FITC，驴抗山羊FITC（Life,美国）。

2. 实验分组

雄性SD 大鼠200～300 g，由徐州医科大学实验动物中心提供，在12 h 光照/黑暗交替、23±1◦C的安静环境中静养（自由进食水）5 天以上。第一步：将实验动物随机分为5 组：sham 组、CCI 1 天组、CCI 3 天组、CCI 7 天组、CCI 14 天组(n= 6)。第二步：实验动物随机分为6 组： CCI + NGF 抗体组、CCI + PBS 组、CCI + 对照抗体组、sham + NGF 抗体组、sham + PBS 组、sham + 对照抗体组(n= 6)。

3. 模型建立

大鼠腹腔注射10%水合氯醛(30 mg/kg)麻醉，将其固定于手术台上，手术区备皮消毒。下肢背侧沿肌肉纹理走行做斜行切口 ，经股二头肌肌间行钝性分离至暴露坐骨神经主干，用铬制羊肠线做间距为1 mm 的4 道结扎，结扎线松紧度以不影响神经外膜的血运为宜，然后逐层缝合，手术野消毒。sham 组不做铬肠线结扎，其余方法同上。

4. 行为学测定

（1）热痛阈 (thermal withdrawal latency, TWL)：大鼠置于3 mm 厚的玻璃板上，按Hargreaves 法用热痛敏刺激仪照射大鼠足底。照射开始至大鼠出现抬腿回避的时间为TWL。自动切断时间为30 s，以防止组织损伤。热刺激强度在整个实验过程中维持一致。每只测定5 次，每次间隔5 min，取后3 次比较平稳的数据算平均值为TWL 值。于术前1 天、术后1、3、7、14 天检测。

（2）机械痛阈(mechanical withdrawal threshold, MWT)：将一透明玻璃箱 (22 cm × l2 cm × 22 cm) 置于金属筛网上，待大鼠在有机玻璃箱中适应15 min后，用vonFrey 纤维丝垂直刺激大鼠左后肢足底中部，持续时间≤6 s，大鼠出现抬足或舔足行为视为阳性反应，否则为阴性反应。测定首先从2 g开始，当该力度的刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激；如出现阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激，如此连续进行，直至出现第一次阳性和阴性反应的骑跨，再连续测定4 次。最大力度为26 g，大于此值时记为26 g。每次刺激间隔30 s。

5. 大鼠侧脑室注射CB-HRP

取材前48 h，用10%水合氯醛 (300 mg/kg) 腹腔注射麻醉大鼠，固定于脑立体定位仪，参照Paxinos 和Warson《大鼠脑立体坐标图谱》坐标：(Brega: 1.2 mm±0.4 mm，Deep: 3.2 mm±0.4 mm，Right to median sagittal plane: 1.4 mm±0.2 mm)，每只单侧侧脑室注射30%CB-HRP（北京协和医科大学解剖学教研室）3 μl，留针15 min，在适宜、避强光的环境中喂养48 h。

6. 免疫荧光

大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg 体重）腹腔注射麻醉后，行左心室-主动脉插管依次灌注生理盐水150 ml 和4%多聚甲醛溶液350 ml 固定。取大脑组织后，放入4%多聚甲醛溶液中4℃后固定过夜；转入30%蔗糖溶液中4℃脱水至组织沉淀，冰冻冠状切片，片厚40 μm，取相应脑干区域的切片。切片收集在0.01 mol/L PBS 中，经0.01 mol/L PBS 冲洗3 次×5 min。选取完整切片至24 孔孵育板中，加入含0.1% Triton-100 的3%牛血清封闭液，室温封闭2 h；切片加入Anti-CB 和Anti-NGF 一抗 (1:500) 混合抗体或Anti-CB 和Anti-p-ERK (1:500)一抗混合抗体孵育48 h，再加入FITC 标记的驴抗羊和FITC 标记的驴抗兔 (1:400) 孵育1 h。上述各步骤间用0.01 mol/L 的PBS 充分漂洗。贴片、甘油封片，激光共聚焦显微镜 (LSCM, LeiCa TCS SP2, Germany) 避光下对脑组织切片进行观察并摄片。

7. Western Blot

将动物断头处死后迅速取出触液核，以1:10的比例加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，超声下裂解细胞后，4℃12 000 rpm 离心30 min，取上清。BCA 法测定样品的蛋白含量，10% 聚丙酰胺凝胶分离蛋白，电泳后将蛋白转移到PVDF 膜。5%的脱脂奶粉溶液于封闭1 h，兔抗NGF、兔抗p-ERK、兔抗ERK、小鼠抗β-actin 4 度孵育过夜，TBST缓冲液冲洗3 次，加入相应二抗，室温孵育1 h，TBST 缓冲液冲洗3 次。用Image J 软件进行相对灰度值分析。

8. 统计学分析

采用SPSS 16.0 软件对数据进行统计分析。多组比较采用one-way ANOVA，两两比较采用q检验。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.行为学表现

在神经病理性疼痛条件下，CCI 组大鼠在CCI后出现术侧后足轻度内收、后足外翻和跛行。对照组大鼠术前和术后MWT/TWL 值未见明显变化 (P＞ 0.05)。CCI 后3 天，CCI 大鼠 MWT/TWL 值显著降低，低于术前的基础值(P＜ 0.05)。与术前比较，CCI 大鼠MWT/TWL 值持续降低至术后14 天 (P＜ 0.01)，并在第7 天达到峰值（见图1A, B）。

2. NGF 和ERK 在正常大鼠触液核的分布

在激光共聚焦显微镜下，图2 可见红色荧光标记的CB-HRP 细胞即远位触液神经元，红色荧光主要存在于胞体和突起，呈圆形或椭圆形，远位触液神经元胞体主要集中分布于触液核所在部位。NGF标记细胞呈绿色荧光，与触液神经元共表达呈黄色荧光。图3 可见红色荧光标记的CB-HRP 细胞即远位触液神经元，p-ERK 标记细胞呈绿色荧光，与触液神经元共表达呈黄色荧光。

3. CCI 大鼠触液核中的NGF 表达上调

由于前一步实验证明了NGF 在正常大鼠的触液核中有表达，进一步研究其是否参与了神经病理性疼痛。Western Blot 结果发现大鼠触液核内NGF于CCI 第3 天明显上升，并持续至第14 天（见图4）。

4.侧脑室注射NGF 抗体可以减轻神经病理性疼痛大鼠的痛行为

触液核的NGF 在CCI 术后明显提高，因此NGF 很有可能在慢性神经病理性疼痛的发病机制中起着重要作用。为了进一步明确本研究的假设，采用侧脑室注射NGF 抗体。结果发现，侧脑室注射NGF 抗体 (10 μg/i.c.v. ) 24 h 后，MWT/TWL 值均提高（见图5）。

5.侧脑室注射NGF 抗体下调CCI 大鼠触液核p-ERK 的表达

MAPK 信号转导通路被发现参与了NGF 的胞内信号转导[15]。本研究假设触液核NGF 可能是通过ERK 信号通路的激活发挥了其致痛作用。因此检测NGF 抗体是否影响触液核p-ERK 的表达，结果发现，在侧脑室注射NGF 抗体24 h 后，触液核p-ERK 的表达较对照组明显降低，因此触液核NGF/ERK 信号通路可能参与了神经病理性疼痛（见图6）。

讨 论

临床上检测脑脊液可以诊断疾病，一些静脉注射无效的药物，经脑脊液途径给药却可产生明显疗效。然而，由于脑-脑脊液屏障和血-脑屏障的存在，这些药物是如何发挥作用的呢？有理由推测，在脑-脑脊液之间可能存在着一种特殊的信息传递结构基础。本课题组通过侧脑室注射CB-HRP 示踪发现CSF-CN 主要位于脑干内中脑导水管的腹侧面，远位触液神经元胞体位于脑实质内，长突起伸入脑脊液及脉管系统，具备穿越血-脑屏障和脑-脑脊液屏障的结构基础。既往研究发现触液核与吗啡依赖、痛觉调制等中枢神经系统疾病密切相关[5,7]。神经损伤后，受损的神经元、痛觉感受器以及下行调控系统出现大量变化，继而发展为神经病理性疼痛。本课题组近年来研究表明CSF-CN 可能与疼痛信号的转导及调控相关，如触液核通过致痛物质P 物质、ASIC3、Wnt5a 参与了疼痛[5,7]，靶向毁损触液核，CCI 大鼠及炎性痛大鼠痛行为状明显减轻[16]。

研究发现NGF 在炎性痛及神经病理性疼痛中发挥作用，在外周神经损伤模型中，NGF 在背根神经节及脊髓背角上调[17]。NGF 抗体可以减轻CCI大鼠的痛觉过敏，并且不产生耐受[18]。目前关于NGF 的研究主要在脊髓以下水平，大脑高级中枢研究很少。本研究采用了形态学手段，免疫荧光双标证实了触液核有NGF 表达。结合行为学检测和Western Blot 半定量分析发现CCI 大鼠触液核NGF表达量于CCI 后第3 天开始明显上升并持续至第14天；采用侧脑室注射NGF 抗体可以减弱触液核中NGF 介导的痛行为。MAPK 信号转导通路被发现参与了NGF 的胞内信号转导[19]。因此为了进一步明确NGF 参与疼痛的分子机制，检测侧脑室注射NGF抗体后触液核ERK表达情况的变化。结果发现，NGF 抗体组大鼠ERK 表达量较溶媒组明显降低。因此侧脑室注射NGF 抗体很有可能通过抑制触液核NGF/ERK 信号通路发挥其镇痛作用。

神经病理性疼痛机制复杂，多个脑区被认为参与了疼痛的发生与调控。触液核是脑内的新发现核团，对其功能的研究很少。本研究表明触液核可能是参与神经病理性疼痛行成与维持的核团之一。本研究中，经脑脊液途径拮抗大鼠触液核内部的NGF可以明显减轻大鼠的痛行为。触液核不仅在脑与脑脊液之间，更参与了中枢与外周之间的信息传递，可能还具有强大的摄取、转运及内分泌功能。因此，可以以触液核为靶点，研究神经病理性疼痛的发病机制，开发从脑脊液途径的药理学干预措施，为神经病理性疼痛的治疗提供新思路。