一起甘肃高山细毛羔羊大肠杆菌病的实验室诊断与防治

佘海瑞，贺雪丽

（1.甘肃省肃南裕固族自治县康乐镇农牧技术服务站，甘肃 肃南 734400；2.甘肃省肃南裕固族自治县动物疫病预防控制中心，甘肃 肃南 734400）

1 发病情况

肃南县康乐镇赛鼎村张某饲养高山细毛羊185只，截至2020年4月15日产羔80只，4月8日开始羔羊发病，发病羔羊年龄段不一（3～20日龄），且均为膘好母羊所产的体格大强健羔羊，到4月15日，发病31只，死亡20只。

2 临床症状

病初体温升高到42℃，精神委顿，结膜潮红，呼吸困难，四肢僵硬，运步失调或跛行继而卧地不起，食欲不振、发抖，口流清涎。未经治疗的病羔羊多数在发病后24 h内死亡。经治疗的病羔羊跛行稍好转，停药即复发，2～3 d治疗无效死亡。

3 剖检变化

肝脏及胆囊肿大，肝呈黑紫色，肾脏有出血点，质地无明显变化。腹水增多，并具有恶臭味，其他器官无病变。

4 实验室诊断

4.1 涂片观察

剪取肝、肾、淋巴结组织样品和肠内容物做涂片，然后对涂片进行革兰氏染色，在显微镜下观察。

4.2 细菌分离及鉴别培养

将肝、脾、肺、肾组织，在生物安全柜内表面消毒（过火焰）、十字切口后从内部组织剪取约1 g（黄豆大小）组织分别直接接种在TSA 培养基和血琼脂培养基上，倒置于37℃恒温培养箱中培养18 h，观察结果，并进行细菌纯化。将分离、纯化的待检菌分别接种麦康凯琼脂, SS琼脂上，倒置于37 ℃恒温培养箱中培养18 h，观察结果。

4.3 药敏实验

挑取单菌落接种于4.5 mlTSB培养基中，37℃培养16 h。用无菌生理盐水将培养好的菌液做1：20稀释，制成均匀悬液。经与浊度管（0.5 麦氏单位比浊管）比较，浊度一致。取100 ul稀释过的菌液用涂菌棒均匀地涂于TSA培养基表面。平板放置于37℃ 3～5 min 后，用无菌镊子取药敏纸片，贴于一平板表面，并轻压一下纸片，使其贴平。每张纸片间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm。孵育：贴好纸片后在15 min 内放到37℃孵育箱，将平板倒置培养。平板孵育16～18 h后取出。

培养后取出平板，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。用游标卡尺量取抑菌圈的直径，并判定试验结果。

4.4 实验动物攻毒试验

挑取单菌落接种于4.5 ml TSB 培养基中，37℃ 培养16 h。取0.2 ml/只，腹腔注射3只普通级昆明小鼠，另用3只作为对照，注射0.2 ml的TSB培养基。观察并记录小鼠的临床表现及死亡情况。

4.5 PCR产物测序，BLAST 分析

用细菌基因组DNA 提取试剂盒DNA，细菌16 SRNA通用引物进行扩增、电泳后，经凝胶成像系统成像，观察结果后直接用PCR产物送公司测序，BLAST 分析。

用大肠杆菌特异性引物uidAF/uidAR对上述样品DNA再次进行PCR检测。

4.6 实验室诊断结果

4.6.1 涂片观察 从肝、肾、淋巴结、肠内容物涂片中明显观察到菌体（见图1），初步判定为大肠杆菌。

图1 组织涂片革兰氏染色（100倍）

4.6.2 培养菌落形态及特性 其中使用肝、脾、肺组织划线的培养基有菌落生长，其余组织无菌落生长。TSA 培养基平板上形成隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的灰白色菌落；血琼脂平板上不溶血；SS 琼脂、麦康凯琼脂上形成粉红色菌落。挑取单个菌落进行革兰氏染色，镜检可见中等大小的革兰氏阴性球杆菌, 两端钝圆。

4.6.3 药敏试验 药敏试验结果见表1。

表1 药敏试验

4.6.4 动物攻毒试验结果 在注射18 h后3只实验组小鼠全部死亡，对照组无反应。无菌采取死亡小鼠肝脏进行细菌分离培养鉴定, 分离出与病原菌一致的细菌。

4.6.5 PCR产物测序及BLAST 分析 结果见图2。

图2 BLAST分析结果为大肠埃希氏菌

4.6.6 大肠杆菌杆菌特异性引物PCR检测 结果（见图3）。

图3 PCR结果图

4.6.7 实验室诊断结论 分离的培养物经菌落、菌体形态观察、药敏试验、动物攻毒试验和PCR产物送公司测序后BLAST 分析、大肠杆菌杆菌特异性引物PCR检测，确诊为致病性大肠杆菌。

5 防治

5.1 预防措施

5.1.1 注意羊圈、环境及用具的消毒 每年的产羔前两周至产羔结束，期间要每隔一周进行彻底消毒。地面、墙面喷雾消毒后密闭，熏蒸消毒。产羔期及时进行圈舍及环境中的胎衣的清理工作，每天喷雾消毒1次，消毒药物替换使用。常用消毒药物如强力消毒灵、84消毒剂等。

5.1.2 加强怀孕母羊饲养管理 注意补饲，采用全价饲料和多种饲草饲喂，避免营养缺乏。

5.1.3 搞好初生羔羊的护理 注意保暖，保证吃到初乳，对刚出生的羔羊及时扎脐并用5%碘酊进行脐带浸泡消毒。

5.1.4 对新生羔羊全部进行药物预防 在羔羊出生1～2d内用土霉素片粉或多西环素2 g 用适量炼制猪油(约1 cm3)拌匀后，吞服，每天1次，连用3d，或用庆大霉素在羔羊出生1 d后2ml进行灌服，连用3 d。

5.2 治疗措施

5.2.1 及时隔离病羔，加强圈舍及环境的卫生清理和消毒，对病死羔羊采取严格的无害化处理措施。

5.2.2 对病羔羊进行药物治疗：头孢曲松或头孢噻肟0.1g配用注射用水肌注，每天1次，连用3 d。对有关节症状或发热严重者的用头孢曲松或头孢噻肟0.1g配用2 ml地塞米松磷酸钠、安痛定3 ml肌注。

5.2.3 加强饲养管理，怀孕母羊和产羔母羊及时分群。

5.2.4 对羔羊进行全群药物预防，按5.1.4办法进行，可适当加大预防剂量。

5.2.5 母羊产羔后及时用0.1%的高锰酸钾水擦拭母羊的乳房、乳头和腹下。

6 讨论

大肠杆菌菌为条件性致病菌，本病的发生与当地的气候条件和饲养管理有一定的关系。当地甘肃高山细毛母羊每年10月底配种，来年3月底开始产羔，母羊怀孕的大部分时期及产羔期是枯草期，当地气候条件寒冷，母羊怀孕和产羔期气候寒冷多变，传统的放养方式中母羊人工补饲时间短，且饲草品种单一，导致母羊营养缺乏，加之气候多变使羔羊的抵抗力降低是该病发生的重要诱因。

对母羊或羔羊使用疫苗来预防该病，笔者并不赞同使用疫苗，首先是大肠杆菌血清型多，其次是羔羊往往还来不及产生抗体就已经发病死亡。所以对于该病的预防重在饲养管理。