促性腺激素释放激素在牦牛睾丸中的免疫组化定位

叶桐桐，龙琴琴，李洪珊，柳佳佳，姚一凡，龚赛赛，杨 琨

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730100）

牦牛主要分布在我国青藏高原及其周边的高原地区，是当地牧区的特产动物。其生活环境较为寒冷且含氧量极低，因此，牦牛的生长繁殖有高原适应性并且会随着季节的变化而变化[1]。促性腺激素释放激素是一种由下丘脑分泌的神经调节物质，通过下丘脑—垂体—门循环进入垂体前叶，刺激促黄体素（LH）和促卵泡激素（FSH）的分泌，其中LH可以促进睾酮的生成，FSH可以促进精子的生成，对睾丸的生理过程和牦牛的生长繁殖阶段起关键性作用[2]。此外，GnRH及其受体还广泛存在于垂体轴之外的生殖组织之中，如卵巢、子宫、前列腺等，可见其对于动物体的生殖繁衍有着举足轻重的作用。本研究是采用免疫组化SP染色方法检测GnRH在牦牛睾丸不同细胞中的分布特征，为深入阐明GnRH在睾丸中的作用机理提供理论依据，并对提高GnRH在牦牛的生长繁殖的应用提供理论资料。

1 材料与方法

1.1 试验动物

3头健康成年雄性牦牛的睾丸组织采于甘肃省临夏回族自治州某屠宰场，并用4%多聚甲醛固定。

1.2 试剂与仪器

试剂主要有购自北京博奥森技术有限公司的兔GnRH多克隆抗体（bs-10369R）免疫组织化学检测试剂盒（sp-0023），购自北京索莱宝科技有限公司的DAB浓缩型显色试剂盒；仪器设备主要有病理组织切片机、显微镜照相系统等。

1.3 HE染色及免疫组化SP染色

1.3.1 取材与固定 试验动物采用颈动脉放血的方式致死，后迅速将睾丸组织取出，将外层白膜玻璃后迅速放入4%多聚甲醛中固定12 h后更换新的固定液存放。

1.3.2 HE染色 石蜡切片（5μm）经酒精脱蜡至水后；苏木精染核，伊红染细胞质后经酒精分化，随后脱水、透明、封片即可。

1.3.3 免疫组化SP染色 石蜡切片（5μm）经酒精脱蜡至水后，蒸馏水和PBS分别浸泡5 min；经抗原修复（柠檬酸盐缓冲液-微波热修复法）、阻断、封闭后滴加一抗工作液孵育（37℃湿盒中）；随后二抗、三抗反应后，滴加DAB显色液，在显微镜下观察适度停止反应；随后用苏木精复染、盐酸酒精分化，脱水、透明、封片即可。

其中，阻断用液、封闭用液、二抗和三抗工作液来自免疫组化SP试剂盒；一抗来自兔GnRH多克隆抗体（工作浓度1：400）。

1.3.4 图像采集与结果判定 经免疫组化染色后的切片，强阳性表达呈较深棕黄色，阳性表达颜色次之，弱阳性表达颜色次于阳性但深于背景色，阴性对照无颜色表达或与背景色相似。

2 结果与分析

2.1 牦牛睾丸组织学构造（HE染色×100）

图1所示，可见许多生精小管横断面，其管壁由大量细胞组成，主要为生精细胞和支持细胞。生精细胞由上皮深部到浅部增殖分化，最深层一般为精原细胞，从青春期便开始增殖分化为初级精母细胞。再通过细胞分裂为次级精母细胞，最终经过演变分化在上皮浅部生成精子。支持细胞能够推动生精细胞移向管腔。生精小管之间的疏松结缔组织中分布着大量的睾丸间质细胞，具有分泌雄激素类固醇的作用。

图1 牦牛睾丸HE染色结果

2.2 促性腺激素释放激素在牦牛睾丸中的定位（免疫组化SP染色×100）

如图2所示，睾丸组织中的生精小管的生精细胞的胞质和疏松结缔组织中的睾丸间质细胞的胞质中可见深棕黄色到黄色的阳性表达。并且与图3相比，后者无着色呈阴性，说明试验结果具有特异性，结论可靠。最终可从图2中得到，GnRH阳性物质主要分布于睾丸的生精细胞与间质细胞之中，尤其在生精细胞中表达较强。

图2 牦牛睾丸免疫组化染色结果

图3 牦牛睾丸免疫组化阴性对照

3 结论与讨论

由试验结果可得，GnRH在牦牛睾丸间质细胞和生精细胞中均可见阳性表达，在生精细胞中呈强表达，间质细胞中的表达稍次之。由此说明其与牦牛的生殖功能一定有所关联，一是GnRH通过下丘脑—垂体—性腺轴刺激LH和FSH的分泌，从而促进睾酮和精子的生成；二是GnRH及其受体广泛存在于动物机体其他组织之中，如前列腺、子宫、卵巢等，并在其中通过旁分泌或自分泌的方式在局部调节生殖激素[3，4]。

GnRH、LH、FSH是睾丸实现生殖功能，机体实现生长繁殖中不可或缺的3种调节因子，GnRH经由下丘脑—垂体—性腺轴这一过程，刺激LH和FSH的分泌。其中LH主要作用于睾丸间质细胞，促进其产生睾酮；FSH作用于生精细胞和支持细胞，从而影响精子的产生和激素的分泌。相反地，如果动物机体遭遇外界因素或自身机能衰退的影响，导致睾丸病变或损伤，间质细胞萎缩，则会引起机体激素分泌异常，从而反馈性的抑制垂体和下丘脑的功能，以减弱其分泌LH和FSH的能力。LH产生的睾酮可以刺激生殖器官的发育、精子的发生和骨质生成等，并且对雄性第二性征和性成熟有不可替代的作用。而FSH也能与LH配合使卵泡内膜细胞分泌雄激素[5-8]。与此同时，GnRH还表现出与人体绒毛膜促性腺激素相似的功能，如促进精子活力、增强精液品质[9]。对于雄性动物，尤其是哺乳动物而言，生理浓度的GnRH与LH有极其相似的作用并且在临床试验中不具有种族特异性，与机体不产生抗原抗体反应，但在临床应用中的具体方案还需进一步试验确定[10,11]。

GnRH在动物体内的作用会根据它所处组织不同而不同。有研究表明：下丘脑中的GnRH可调控促性腺激素的释放；胎盘中的GnRH可调控人体绒毛促性腺激素的分泌；肿瘤中的GnRH可调控癌细胞的增殖等。而在生殖系统中，GnRH及其受体可通过旁分泌或自分泌的方式，在局部调节血浆促性腺激素和类固醇激素的水平，从而影响动物体的生殖功能[12]。本研究通过定位GnRH在牦牛睾丸组织中的分布，主要在睾丸生精细胞及间质细胞中，且在生精细胞中表达较强，间质细胞次之的结论，为完善充实以上调节机制提供了更新的理论依据。