长期秸秆还田与施肥对潮土酶活性和真菌群落的影响

李月，张水清，韩燕来，李世莹，王祎，李慧，李芳*，谭金芳

1. 河南农业大学资源与环境学院，河南 郑州 450002；2. 河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，河南 郑州 450002；3. 中山大学农学院，广东 广州 510000

秸秆富含有机质及各种营养元素，是重要的有机肥资源之一（Zhang et al.，2014），秸秆还田在中国乃至全球农业生产中应用广泛（Xu et al.，2018；Dhaliwal et al.，2020）。石含之等（2020）的研究表明，秸秆还田有助于优化土壤结构、提高土壤肥力。Bai et al.（2019）对中国典型的稻麦轮作农田和Li et al.（2019a）对中国西北地区的玉米长期连作试验发现，秸秆还田均提高了土壤有机碳和全氮的含量。还田秸秆在土壤中的分解转化过程是在土壤微生物的推动作用下进行的。土壤微生物是地球化学元素循环过程的重要推动力，其群落结构及多样性已经成为判断土壤质量状况的重要依据（Veresa et al.，2015；Hartmana et al.，2008）。秸秆还田为土壤微生物的生长和繁殖提供了适宜的碳源和氮源，显著增加了土壤中可利用碳源的含量及碳源种类的多样性（Hao et al.，2019；Su et al.，2019）。秸秆还田势必对土壤微生物群落结构有一定的重塑作用，本课题组前期研究显示，长期秸秆还田改变了华北平原壤质潮土细菌的群落结构，促进了参与复杂有机物质降解的细菌丰度的增加（Li et al.，2017）。然而对其中真菌群落变化规律的认识还不够充分。

土壤真菌对有机物料的降解和腐殖化具有重要影响（Chen et al.，2014）。有机碳含量高的农田土壤其真菌多样性亦较高（Li et al.，2015；Williams et al.，2013）。真菌通过分泌高效的水解酶对秸秆进行分解转化，这些酶亦被沉积到土壤中成为土壤酶的一部分（Chapla et al.，2012）。土壤中物质能量循环是各种复杂的酶促反应推动的，土壤酶是连接土壤微生物和土壤化学过程的重要媒介（Burns et al.，2013）。相对于整个微生物群落，土壤酶活性与特殊真菌群落的关系更加密切（Ling et al.，2014）。纤维素酶、木聚糖酶和β-1, 4糖苷酶是纤维素和半纤维降解过程中的关键水解酶，可将结构复杂的纤维素彻底降解为葡萄糖（Zhang et al.，2006）。碱性木聚糖酶可将木聚糖催化水解成木糖，从而促进秸秆降解（Beg et al.，2001）。秸秆中木质素的降解主要是氧化过程，该过程中的关键酶包括多酚氧化酶、过氧化物酶和脱氢酶，其中多酚氧化酶和过氧化物酶也是土壤腐殖质形成的关键酶（Burns et al.，2013）。土壤酶活性受不同施肥措施的显著影响（李芳等，2015）。基于这几种酶在秸秆降解、土壤腐殖质形成过程中的重要作用，我们通过长期定位施肥试验分析其活性变化规律，深入探究了土壤碳循环相关酶活性与真菌群落结构间的关系。

麦玉轮作是中国黄淮海平原潮土区作物的主要轮作方式，长期秸秆还田对麦玉轮作农田土壤理化性状及真菌群落结构产生了深刻的影响。然而，不同施肥处理下，真菌群落结构如何变化以及变化后对农田生态环境的意义并不十分清楚。因此，本研究基于黄淮海平原潮土区长期定位试验，对不同施肥处理下土壤理化性质进行调查，并运用 Miseq高通量测序技术对土壤真菌群落结构进行解析。通过对应典范分析来解析不同施肥处理下土壤真菌群落结构的分异，采用蒙特分析揭示土壤真菌群落结构变化的主要驱动因子。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

土壤样品采自国家潮土土壤肥力和肥料效益长期监测站，该站1990年建于河南省郑州市，该地区以暖温带气候为主，年平均气温约为14.4 ℃，年降水量约 640.9 mm。种植制度为小麦-玉米轮作。试验地建立时，土壤pH为8.10，土壤有机碳10.60 g·kg-1，全氮 0.64 g·kg-1，速效磷 9.0 mg·kg-1，碱解氮76.6 mg·kg-1（张水清等，2017）。土壤类型为石灰性冲积土（Li et al.，2017）。

1.2 实验设计和样品采集

本研究涉及 3个处理，（1）单施化肥处理（NPK）：玉米季施肥量为 N 188 kg·hm-2、P2O594 kg·hm-2、K2O 94 kg·hm-2，磷钾肥全部作为基肥施入，氮肥按基肥꞉追肥=1꞉1施入，灌浆期追肥；小麦季施肥量为 N 165 kg·hm-2、P2O582.5 kg·hm-2、K2O 82.5 kg·hm-2，其中磷钾肥全部作为基肥施入，氮肥按基肥꞉追肥=1꞉1施入，于返青期追肥，小麦和玉米秸秆均移除。（2）秸秆还田配施化肥处理（SNPK）：2004年前小麦季氮肥70%由玉米秸秆提供，返青期用尿素补充30%的氮，2004年及以后秸秆还田提供50%的氮，返青期用尿素补充50%的氮，总施氮量165 kg·hm-2。磷钾肥施用量与单施化肥处理施用量保持一致。玉米季施肥与NPK处理一致。（3）对照处理（CK）：不施用任何肥料，正常耕作，小麦和玉米秸秆均移除。小区面积为40 m2，设置3个重复。所用氮肥为含氮量45%的尿素；磷肥为含P2O512.05%的过磷酸钙；钾肥为含K2O 60%的氯化钾。

2018年玉米收获后，用五点取样法采集各处理0—20 cm的新鲜土壤。在去除土壤中的石块、植物根系等杂质后，土壤样品过2 mm筛，混匀。之后分3部分保存：一部分室温风干用于测定土壤基本理化性质；一部分 4 ℃保存用于测定土壤酶活性，最后一部分-80 ℃保存用于测定土壤真菌群落结构。

1.3 测定方法

pH 在水（无二氧化碳去离子水）土比 2.5꞉1（V:m）液中，用sartorious PB-10pH计（赛多利斯）测定；有机碳（Soil Organic Carbon，SOC）采用K2Cr2O7外加热法测定；全氮（Total Nitrogen，TN）采用凯氏定氮法进行测定；速效磷（Available Phosphorus，AP）采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定；铵态氮（NH4+-N）采用靛酚蓝比色法测定（鲍士旦，2000）；土壤硝态氮（NO3--N）采用双波长分光光度法测定（涂常青等，2006）。

土壤酶活性的测定方法及单位定义见表 1。其中BAX、POD、PPO和β-GC用苏州科铭公司对应的试剂盒进行测定。

土壤真菌群落测定：采用FastDNA Spin Kit for Soil（MP公司）进行土壤DNA提取，称取0.5—0.6 g保存于-80 ℃的土壤样品，按照试剂盒的操作步骤进行提取。得到的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行完整性及纯度检测，采用 NANODROP ND-1000 V3.7.1进行DNA的浓度测定，高质量的DNA采用 ITS1F（CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA）/ITS2（GCTGCGTTCTTCATCGATGC）（Ghannoum，2010）引物对ITS1区进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）：2×HiFi Hot Start Ready Mix 25 μL，引物（10 μmol·L-1）各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 反应程序：94 ℃·5 min，94 ℃·30 s，55 ℃·30 s，72 ℃ 30·s，28 个循环；72 ℃·10 min。使用凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl洗脱后，用1%琼脂糖电泳检测。得到的PCR产物进行等摩尔浓度混样之后建库，在 Illumina MiSeq测序平台上进行双端测序。下机序列进行去除barcode和primer优化，利用Trimmomatic软件对原始序列进行质控，去掉错配率过高（＞0.2）和质量较低（质量值＜20）的序列，最小保留序列长度为200 bp（Caporaso et al.，2010）；用 Flash 软件对序列进行拼接，设置最小overlap为10 bp，允许最大错配率为 0.2，得到 Fasta序列（Magoč et al.，2011）。去除 clean-tags中的重复序列后，将序列相似度≥97%的序列归为一个 OTU 并进行统计（Edgar，2013；Torbjørn et al.，2016）。运用真菌 ITS 数据库Unite（http://unite.ut.ee/index.php）对代表性OTU进行分类注释，便于下游分析。测序结果已上传至NCBI SRA数据库，接收编号为：PRJNA592885。

表1 土壤酶活性测定方法及酶活性定义Table 1 Determination of soil enzyme activity and its definition

1.4 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 26进行单因素方差分析（ANOVA），对不同真菌属丰度与土壤理化性质之间进行Spearman相关分析。使用R软件vegan包进行典范对应分析（CCA）和蒙特分析，采用Graphpad 8.0进行图片的可视化。

2 结果与分析

2.1 长期不同施肥处理下土壤化学性质变化

与对照相比，单施化肥处理和秸秆还田处理均引起土壤pH的显著下降（表2）。与不施肥对照相比，秸秆还田配施化肥处理显著提高了SOC含量，增幅达45.21%；单施化肥处理的SOC含量与对照相比无显著差异。单施化肥和秸秆还田配施化肥处理均显著提高了土壤TN、NO3--N和AP含量；秸秆还田配施化肥处理增幅较大，分别为 91.11%、16.98%和182.75%。土壤NH4+-N含量在各处理间差异不显著。

2.2 长期不同施肥处理下土壤酶活性变化

与对照相比，单施化肥处理显著增加了PPO活性，增幅为41.39%，秸秆还田条件下该酶活性无显著变化（表3）。秸秆还田配施化肥显著提高了土壤POD活性，增幅为80.89%。与对照相比，秸秆还田配施化肥处理中β-GC活性增加了20.06%，而单施化肥处理中其活性降低了24.08%。单施化肥与秸秆还田处理均显著增加了土壤CL活性，增幅分别为53.66%和60.16%。土壤BAX活性在各处理间无显著变化。

表2 不同处理下土壤化学性质Table 2 Chemical properties of soils in different treatments

表3 不同处理下土壤碳循环相关酶活性Table 3 Soil carbon cycling related enzymes activity in different treatments

2.3 长期不同施肥处理下土壤真菌群落结构变化

Miseq高通量测序共得到 615217条序列，按最小样本数进行抽平行后展开分析，每个样品保留序列数为29659。与对照相比，Ace指数和Chao指数在秸秆还田配施化肥处理下显著增加，表明秸秆还田配施化肥处理显著提高了土壤真菌 α-多样性（图1）。

真菌群落主要包括子囊菌门（30.32%—84.23%）、担子菌门（2.27%%—66.27%）、接合菌门（1.20%—4.17%）、壶菌门（0.005%—0.30%）、球囊菌门（0.35%—1.57%）和Rozellomycota（0.03%—0.96%）。典范对应分析（图2）显示，长期单施化肥、秸秆还田配施化肥处理中潮土真菌群落结构与对照相比出现明显分异。结合蒙特分析结果（表4），引起不同施肥处理下真菌群落结构分异的主要影响因子是POD、β-GC、SOC以及TN。对主要的真菌（属水平）进行统计分析，发现9个真菌属在不同处理间呈现显著性变化（图3）。与对照相比，长期秸秆还田处理中弯孢菌属（Curvularia）、篮状菌属（Talaromyces）、赤霉菌属（Gibberella）、镰刀菌属（Fusarium）、被孢霉属（Mortierella）、毛壳属（Cheatomium）以及枝顶孢属（Acremonium）真菌相对丰度显著增加，毛霉属（Piloderma）和口蘑属（Tricholoma）真菌相对丰度显著下降。与对照相比，单施化肥处理中枝顶孢属（Acremonium）真菌相对丰度显著降低。

图1 不同处理下土壤真菌群落α-多样性指数Fig. 1 α-diversity index of soil fungal community under different treatments

图2 典范对应分析展示真菌群落分异及其主导性因子Fig. 2 Fungal community differentiation and its driving factors revealed by canonical correspondence analysis

表4 蒙特分析展示土壤真菌群落相关的生物化学性质Table 4 The biochemical factors that correlated with fungi communities based on Mantel tests

2.4 真菌优势属丰度与土壤化学性质和酶活性的相关性分析

图3 不同处理间丰度显著变化的真菌（属水平）Fig. 3 Fungal genus with significant changes in different treatments

图4 土壤真菌相对丰度与环境因子相关性分析Fig. 4 Correlation analysis of soil fungal relative abundance and environmental factors

通过 Spearman相关分析解析真菌群落组成与土壤生物化学性质之间的关系（图4）。其中枝顶孢属（Acremonium）、镰刀菌属（Fusarium）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、篮状菌属（Talaromyces）、弯孢菌属（Curvularia）均与土壤β-GC活性显著正相关，而口蘑属（Tricholoma）真菌与β-GC显著负相关；毛霉属（Piloderma）、链格孢属（Alternaria）与POD活性显著负相关；镰刀菌属（Fusarium）、赤霉菌属（Gibberella）、篮状菌属（Talaromyces）、木霉属（Trichoderma）与 NO3--N极显著正相关（P＜0.01），链格孢属（Alternaria）与NO3--N显著正相关；镰刀菌属（Fusarium）、赤霉菌属（Gibberella）、篮状菌属（Talaromyces）、木霉属（Trichoderma）与 TN显著正相关；链格孢属（Alternaria）、篮状菌属（Talaromyces）、口蘑属（Tricholoma）与 SOC显著正相关，赤霉菌属（Gibberella）与 SOC极显著正相关（P＜0.01），而毛霉属（Piloderma）则与SOC显著负相关。

3 讨论

与不施肥对照相比，28年的秸秆还田配施化肥显著提高了土壤SOC、TN含量，这与国内其他长期试验地的研究结果一致（Ye et al.，2019；Li et al.，2019b）。Liu et al.（2019）研究发现，秸秆来源养分的持续加入激发了土壤微生物的活性，微生物量的增加促进了秸秆碳在土壤中的累积（Liu et al.，2019）。本研究中，单施化肥处理TN含量与对照相比增加了13.54%，达到显著水平，但SOC的增加不显著。化肥的添加促进植物生长，最终增加土壤碳输入，然而这种增加可能被土壤碳矿化速率的增加所抵消。长期氮肥输入促进了轻组有机碳的矿化，却使重组有机碳更加稳定，整体上化肥添加对土壤有机碳总量的影响存在很大变异性（Neff et al.，2002）。

土壤β-GC、CL、POD酶活性在长期秸秆还田条件下显著上升。其中β-GC是细胞结合型胞外酶，属于纤维素酶的一种，被微生物分泌到胞外后，需要与细胞结合才能发挥作用，其活性与产酶真菌关系密切（Richard et al.，2013）。枝顶孢属（Acremonium）、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属（Penicillium）、篮状菌属（Talaromyces）等均被证明具有较高的纤维素酶分泌能力（Manglekar et al.，2020）。结合本研究结果，枝顶孢属（Acremonium）、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属（Penicillium）、篮状菌属（Talaromyces）、弯孢菌属（Curvularia）真菌可能共同贡献了土壤中β-GC、CL酶活性的上升。POD是一种氧化型含铁木质素降解酶，具有很高的还原力，使用H2O2作为电子受体，其主要在秸秆降解的后期发挥关键作用（Wen et al.，2019）。POD酶同时参与芳香性有机物的降解和腐殖化过程，其作用机理非常复杂。许多担子菌门真菌具有大量编码胞内和胞外木质素酶的基因，同时大量细菌亦可产生POD酶（Richard et al.，2013）。本研究中，POD酶活性与链格孢属（Alternaria）、毛霉属（Piloderma）真菌丰度显著负相关，与曲霉属（Aspergillus）、篮状菌属（Talaromyces）正相关但未达到显著性，可能与细菌对POD酶的贡献有关。

前人研究显示，有机物料的添加可促进土壤微生物群落从快速生长的致病菌向慢速生长的有益菌方向转化，最终提升了土壤中有益真菌的相对丰度（Yang et al.，2019）。本研究中，长期的秸秆添加引起了9个属真菌丰度的显著性变化。其中绝大部分真菌具有很强的秸秆降解能力。例如枝顶孢属（Acremonium）真菌可以合成分泌胞外 1, 6-β-葡聚糖酶和1, 3-β-葡聚糖酶，对秸秆进行高效降解（Li et al.，2019c； Jayus et al.，2002）；镰刀菌属（Fusarium）真菌可通过产生碱性木聚糖酶对秸秆进行有效降解（Ramanjaneyulu et al.，2017）。同时，青霉菌属（Penicillium）真菌有很强的纤维素、半纤维降解能力，易被周期性加入的秸秆所激发（Singhvi et al.，2011）。被孢霉属（Mortierella）和毛壳属（Cheatomium）真菌受有机添加物质的强烈激发，它们亦被报道有一定的纤维素降解能力（Li et al.，2018）。总之，秸秆周期性的加入对纤维素降解真菌具有显著地刺激作用。

秸秆周期性加入激发的真菌对土壤生态环境意义重大。在长期秸秆还田条件下镰刀菌属（Fusarium）真菌丰度的显著增加已经被前人报道（Wicklow et al.，2005），尽管该属真菌常被认为是禾本科作物的致病菌（Cobo-Diaz et al.，2019），亦有研究证明部分镰刀菌对预防作物土传病原真菌有良好的效果（Kavroulakis et al.，2007）。枝顶孢属（Acremonium）可在玉米根系内定植，其合成的抗生素Pyrrocidine A和Pyrrocidine B能够有效抑制黄曲霉、立枯丝核菌和褐腐镰刀菌等病原真菌的生长（Wicklow et al.，2005；Wicklow et al.，2009）。毛壳属（Cheatomium）真菌产生的毛壳菌素对许多病原真菌有显著的抑制作用，同时该属真菌可促进作物生长、提高作物产量（Vasanthakumari et al.，2014）。青霉菌属（Penicillium）真菌对多种植物病原菌均有一定的防治作用（Larena et al.，2003）。被孢霉属（Mortierella）真菌可通过分泌草酸刺激多种类型土壤中磷的溶解，促进有效磷浓度的增加，在有机碳累积中亦发挥重要作用（Clemmensen et al.，2014；Nelson et al.，2014）。综上，长期秸秆还田激发了秸秆降解真菌丰度的显著提高，其中大部分是有益菌，它们广泛参与土壤碳周转和养分转化，而小部分病原菌的致病性也可被有益菌分泌的抗生素所抑制。总体上，长期秸秆还田条件下真菌群落结构得到优化。

4 结论

长期秸秆还田配施化肥处理显著提高了土壤SOC、TN和AP含量，提高了POD和CL的活性，促进土壤真菌群落结构的优化，显著增加了弯孢菌属（Curvularia）、篮状菌属（Talaromyces）、赤霉菌属（Gibberella）、镰刀菌属（Fusarium）、被孢霉属（Mortierella）、毛壳属（Cheatomium）以及枝顶孢属（Acremonium）的相对丰度，这些真菌丰度的增加对改良农田土壤生态环境意义重大。