五花血藤提取物对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中凋亡相关因子表达的影响△

杨丹 余德立 孙宝飞 康朝胜 孙江龄 余资江

视网膜缺血-再灌注损伤(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)是视网膜在缺血损伤的基础上，恢复血流灌注后并不缓解视网膜细胞的损伤，反而加剧了细胞的死亡使损伤更严重的现象。近年来，RIRI已成为临床上广泛关注的问题[1]。RIRI的机制十分复杂，包括氧自由基学说、一氧化氮学说、钙通道学说、炎症反应学说、兴奋性氨基酸学说、基因调控学说和细胞凋亡学说等[2-3]，而细胞凋亡学说近几年成为研究的重点[4-7]。目前研究发现，RIRI中存在着神经细胞凋亡现象，且凋亡是视网膜神经细胞丢失的重要因素之一[8-9]。细胞凋亡过程受到多种基因调控，主要有Bcl-2家族、Fas家族、Caspase家族和p53基因等[10]。五花血藤又名大血藤、红藤等，系木通科植物五花血藤的茎。研究表明，五花血藤提取物没食子酸(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)可以通过阻断一氧化氮合酶的产生对视网膜神经节细胞起到保护作用，进而对RIRI起到治疗作用[11]。而我们前期的研究结果也表明，五花血藤提取物(sargentodoxa cuneata extracts,SCE)可促进RIRI后神经节细胞中超微结构的恢复，并能激活抗细胞凋亡因子survivin从而起到一定的抑制凋亡的作用[12]，但是其具体的抗凋亡机制还不是十分明确。因此，本研究通过采用SCE实验性防治大鼠 RIRI，观察其对RIRI后凋亡相关因子Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达影响，进一步阐明SCE对RIRI的保护作用及其可能的抗凋亡机制，以期为临床应用该药治疗视网膜缺血性疾病提供药理学实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选取健康清洁级成年SD大鼠90只，体质量180～250 g，雌雄不限，由贵州医科大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK(黔)(2002-0001)]。随机分为对照组、RIRI组与SCE组。其中SCE组于造模前3 d给予SCE灌胃，每天2次(剂量为10 g·kg-1·d-1)，灌胃持续到取材当日。对照组与RIRI组灌服相同剂量的生理盐水。

1.2 五花血藤提取物的制备采取乙醇搅拌回流提取方法[13]，过滤之后旋转蒸发浓缩，浓缩液预冻后冻干。每次取提取物适量，用蒸馏水制备成含生药1 g·mL-1的药液，无菌密封后置入4 ℃ 冰箱中保存备用。

1.3 主要仪器与试剂LEICA RM2016 转轮切片机(上海莱卡仪器有限公司)，OLYMPUS BH-2 显微镜(日本OLYMPUS公司)，精密电子天平(德国Sartorius公司)。五花血藤(贵州中医药大学第二附属医院中药房)，妥布霉素滴眼液(美国爱尔康公司)，盐酸丙美卡因滴眼液(比利时s.a.Alcon-Couvreur n.v.公司)，兔SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中山金桥生物技术有限公司)，兔抗Bcl-2 (c21)、兔抗Bax (p-19)、兔抗Caspase-3 (p11)抗体及多聚赖氨酸(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 大鼠RIRI模型的建立利用升高眼压法来制造大鼠RIRI模型[14]。大鼠称体质量后给予10 g·L-1戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。将大鼠侧卧位固定于实验台上，选取右侧眼球，滴加盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，将一端连有生理盐水注射液的5号头皮针从大鼠颞侧角膜缘斜刺入眼前房，固定针头并打开注射器。使输液瓶与眼球垂直距离为150 cm，眼压升高至110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，这时可见大鼠瞳孔散大，巩膜变白。持续60 min后，拔出针头，可见大鼠球结膜及巩膜颜色迅速恢复正常，检眼镜下视网膜血供恢复，瞳孔回缩。术中及术后间断滴加妥布霉素滴眼液防止角膜干燥及预防感染。

1.5 大鼠标本的制作RIRI组和SCE组分别于RIRI后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，对照组于相应时间点过量麻醉大鼠后给予心脏灌注40 g·L-1多聚甲醛溶液处死大鼠各6只，立即取出眼球，经Bouin液于4 ℃冰箱中固定24 h。从冰箱中取出标本后用流水冲洗24 h，之后再由蒸馏水浸泡三次，每次10 min。取出后放于干净滤纸上用眼科剪去掉角膜(保留晶状体以保持其形态)，修剪平整后放入体积分数75% 酒精中过夜，随后梯度脱水、石蜡包埋，连续切片，切片厚度为5 μm。

1.6 大鼠视网膜Nissl染色从恒温箱中取出处理好的切片立即放入二甲苯中透明两次，每次 5 min。梯度酒精脱水(体积分数100%酒精5 min、体积分数95%酒精5 min)，然后立即用蒸馏水清洗。待切片晾干后进行焦油紫染色3 min，蒸馏水清洗2次，体积分数70%酒精(即刻)，经观察后放入二甲苯中3 min，中性树脂封片，显微镜观察其形态结构。

1.7 大鼠视网膜免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-peroxidase,SP)免疫组织化学法检测大鼠视网膜中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达。具体方法如下：将切片常规脱蜡至水，甲酸抗原修复5 min，体积分数3% H2O2去离子水孵育10 min灭活内源性酶，滴加山羊血清封闭液，室温15 min，加入一抗(1100)4 ℃冰箱中过夜。取出室温静置30 min复温，滴加生物素化二抗，37 ℃恒温箱中放置40 min。DAB 显色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。其中对照组一抗采用0.01 mmol·L-1PBS代替。

2 结果

2.1 大鼠视网膜Nissl染色结果对照组中视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGC)内Nissl小体丰富，染色较深，呈块状分布;RIRI组中RGC内Nissl小体减少，染色浅且分布不均;SCE组染色情况较RIRI组有所改善(见图1)。

图1 各组大鼠视网膜Nissl染色结果(×200)

2.2 大鼠视网膜免疫组织化学染色结果Bcl-2蛋白的阳性表达为黄色或棕黄色颗粒，主要在细胞浆中表达。Bcl-2蛋白在对照组视网膜中几乎不表达，在6 h、12 h的RIRI组中阳性表达持续升高，24 h时表达开始增强，48 h时达到高峰。SCE组Bcl-2蛋白表达随时间延续而增多，阳性细胞染色较深，但在各个时间点上阳性表达均多于RIRI组。两组各时间点比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1、图2A和图3)。

Bax蛋白的阳性表达为黄色或棕黄色颗粒，主要在细胞浆中表达。Bax蛋白在对照组略有表达，但不明显，在6 h时的RIRI组中视网膜组织可见阳性表达，主要表现在神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)和神经纤维层(nerve fiber layer,NFL)，12 h时阳性表达持续增多，24 h时表达达到高峰，主要表达于GCL、NFL、内核层及内丛状层，48 h时表达减少，72 h时仍有表达延续。SCE组Bax蛋白在各个时间点上阳性表达均低于RIRI组，细胞浆染色较浅，每高倍视野阳性细胞表达均较RIRI组有所下降，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表2、图2B和图4)。

表1 各组大鼠视网膜Bcl-2蛋白表达结果

Caspase-3蛋白的阳性表达为黄色或棕黄色颗粒，主要在细胞核中表达。对照组几乎不表达，在 6 h 时的RIRI组中表达有所上升，12 h时表达达到高峰，48 h时阳性表达下降，72 h时仍可见少量表达。SCE组Caspase-3蛋白的阳性表达在各个时间点上均低于RIRI组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表3、图2C和图5)。

表2 各组大鼠视网膜Bax蛋白表达结果

表3 各组大鼠视网膜Caspase-3蛋白表达结果

图2 各组大鼠视网膜凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达趋势图

图3 各组大鼠视网膜中Bcl-2蛋白免疫组织化学染色结果(×200)

图4 各组大鼠视网膜中Bax蛋白免疫组织化学染色结果(×200)

图5 各组大鼠视网膜中Caspase-3蛋白免疫组织化学染色结果(×200)

3 讨论

RIRI的机制复杂，近年来国内外研究进一步证明细胞凋亡与RIRI密切相关。细胞凋亡不是被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用[15]。其中Bcl-2家族基因在细胞凋亡中起到重要作用，Bcl-2是一原癌基因，通过编码Bcl-2蛋白发挥抑制细胞凋亡的作用[16]。Bax是Bcl-2家族中的一员，发挥促凋亡作用，Bcl-2和Bax通过自身组成同二聚体和彼此之间组成异二聚体的不同比例介导其对细胞存活的生物学效应[7,17]，并通过调控线粒体外膜通透性，控制体内凋亡基因和细胞色素C等的释放从而调控细胞是否存活[18]。在本实验中，Bax蛋白在RIRI后6 h时开始表达，12 h时各层表达明显增加，24 h时表达达到高峰，48 h时表达减弱，72 h时仍可检测到Bax蛋白的表达。而Bcl-2蛋白随再灌注时间的延长，表达量持续增高，于48 h时达高峰，72 h时表达出现下降。从实验数据我们可以看出，RIRI组 6 h、12 h 时的Bcl-2/Bax比例上升，这与Bcl-2蛋白持续升高，自身形成二聚体有关。随后24 h、48 h、72 h时的 Bcl-2/Bax比例是降低的，这时虽然Bcl-2蛋白持续升高，并达到高峰，但Bax蛋白的表达量在该时间点也达到一定高度，并维持较高水平，随着时间的推移，促凋亡因素占主导作用，Bcl-2蛋白虽然可以通过阻止或降解细胞皱缩、染色质浓缩和DNA裂解的发生来缓解视网膜细胞的凋亡，但依旧无法阻止细胞凋亡的趋势。因此在RIRI组72 h时，我们可以看到损伤继续发展，RGC计数下降，NFL明显变薄，内核层细胞明显减少，部分结构不清晰等现象。研究表明，Bcl-2作用于Caspase-3的上游，通过抑制Caspase-3而发挥抗凋亡作用。Bcl-2又是Caspase-3的底物，Caspase-3特异性降解后，其功能由抑制凋亡转为触发凋亡[19]。从结果中我们可以看到，Caspase-3的激活并表达的高峰出现在RIRI的早期，随着再灌注时间的延长，Bcl-2可通过下调Caspase-3的表达来发挥抗凋亡作用。

五花血藤是我国的传统中药，多分布于西南地区。在近几十年的临床运用中，五花血藤主要与其他中草药配伍，用于治疗盆腔炎、子宫内膜异位症、阑尾脓肿等。研究发现，SCE中多糖组分(PSC)A-1和PSCB-1可通过下调诱导型一氧化氮合酶水平，显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞一氧化氮的释放，从而提高血清和肝脏超氧化物歧化酶活性来发挥抗炎作用[20]。研究还发现，SCE能改善局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中炎症的反应，其机制可能是通过抑制凋亡途径增加营养因子对神经元的保护，减少神经细胞凋亡，激活脑细胞的自我保护从而改善海马和皮质区的组织病理学改变，减轻脑缺血再灌注损伤[21]。还有研究表明，SCE可以下调Bcl-2和Mcl-1的同时上调Bax的表达来发挥抗凋亡作用，从而在HepG-2移植瘤中抑制肿瘤细胞的生长而起到抗癌效果，并对正常组织细胞没有明显的毒副作用[22]。鉴于SCE的上述作用，我们在实验中尝试性的运用该药来探索其对RIRI的机制，发现在RIRI的急性期给予SCE可在损伤早期通过上调 Bcl-2 蛋白、下调Bax及Caspase-3蛋白的表达来发挥其抗凋亡作用。

综上所述，我们初步判断SCE对于大鼠RIRI有一定的治疗效果，能缓解RIRI后造成的神经细胞水肿等症状，同时激活抗细胞凋亡因子而起到一定的抑制凋亡的作用。本实验对于贵州传统中药的开发和利用提供了一定的药理学基础。