兔眼超声乳化吸出术后非手术眼房水及血清中TNF-α、IL-1β表达变化与该眼角膜知觉敏感度变化之间的关系△

杨瑞波 于笛 牟芃玥 刘雪梅 赵少贞

目前，白内障仍是我国首位致盲眼病，在所有致盲眼病中约占56.7%[1]。白内障患者多为双眼患病,第一眼白内障手术后,由于双眼视力及屈光状态不一致，患者双眼视功能会受到影响[2],故越来越多患者短期内要求行第二眼白内障手术。但是,临床中部分短期内行第二眼白内障手术的患者常出现术中眼部疼痛较第一眼加重的现象[2]，导致患者配合能力下降[3]，如眼球运动频繁，后房眼压升高，甚至出现心率加快、血压升高、情绪紧张等连带反应，以上情况增加了手术难度及风险，手术并发症发生率(如后囊膜破裂、眼压升高、眼底出血等)也会随之升高，导致患者对第二眼手术的满意度下降。

当前，临床上对于第一眼和第二眼白内障手术眼部疼痛感知差异的研究相对较少，有关第二眼白内障手术痛觉敏感性增强(痛觉过敏)的研究主要限于临床观察水平，缺乏对相关机制的基础研究。本研究通过检测兔第一眼晶状体超声乳化吸出术后不同时期，非手术眼房水及血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的表达及该眼角膜知觉敏感度，并与术前基线值相比，探讨非手术眼房水及血清中TNF-α及IL-1β的变化与该眼角膜知觉敏感度变化之间的关系，进而探讨第一眼晶状体超声乳化吸出术后，第二眼痛觉过敏的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料选取健康成年新西兰大白兔40只作为实验对象，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg(北京维通利华实验动物技术有限公司)，实验前双眼经裂隙灯和眼底检查均正常。常规饲养1周，采用随机数字表法将大白兔分为实验组与空白对照组，实验组25只，空白对照组15只。实验组手术眼与空白对照组第一眼采用随机数字编号入组，实验组一眼行晶状体超声乳化吸出术，根据术后取材时间分为术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d共5组，每组5只动物。空白对照组按照对应取材时间也分为5组，每组3只动物。实验动物的使用均遵循实验动物医学伦理条例及国家实验动物管理保护条例。

1.2 主要试剂及仪器兔TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒(中国Bio-Swamp公司)，血液样品总RNA小计量提取试剂盒(中国Magen公司)，手术显微镜(苏州六六视觉科技股份有限公司)，超声乳化仪(美国Alcon公司)。

1.3 方法

1.3.1 手术方法术前3 d每只兔双眼滴5 g·L-1左氧氟沙星(日本参天制药有限公司)，每天4次，超声乳化吸出术由同一经验丰富的术者完成。术前30 min用复方托吡卡胺(沈阳兴齐制药有限公司)散瞳3 次，术前10 min用表面麻醉剂丙美卡因(南京瑞年百思特制药有限公司)滴眼2次，速眠新Ⅱ注射液(敦化市圣达动物药品有限公司)肌肉注射麻醉(0.3 mL·kg-1)，常规消毒手术野。铺无菌洞巾，开睑器开睑，聚维酮碘(上海利康消毒高科技有限公司)滴眼，生理盐水冲洗结膜囊。

超声乳化吸出术：实验组术眼于房水抽取后自穿刺口向前房注入平衡盐溶液，恢复前房深度。在上方2.2 mm处行透明角膜切口，前房注入黏弹剂，环形撕囊直径5 mm，水分离，超声乳化吸出软核，注吸皮质，角膜切口水密。手术结束后，术眼涂妥布霉素地塞米松眼膏(美国Alcon公司)，清醒后放入兔房正常喂养。术后用药：术后1周内，术眼滴妥布霉素地塞米松滴眼液，每天4次，此后逐周递减1次，4周后停用。

1.3.2 观察并记录实验动物双眼的结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应情况于术前及术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，在裂隙灯下分别观察并记录两组实验动物双眼的结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应情况，兔眼结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应分级标准见表1。

表1 兔眼结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应分级标准

1.3.3 各组兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平检测采用实时定量PCR检测兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平。于术前及术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，分别取实验组与空白对照组兔肢体血液5 mL，离心后取血清，按照试剂盒说明书提取血清总RNA，Nanodrop 2000分光光度计检测RNA的纯度及浓度。将总RNA逆转录后，在实时定量PCR仪上进行PCR扩增，使用GAPDH作为内参照。实时定量PCR所使用引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成,其中TNF-α引物序列：上游为5’-ATGAGCACTGAAAGCATGA-3’，下游为5’- GAGGGCTGATTAGAG-3’；IL-1β引物序列:上游为5’-GTCTTCCTAAAGCAAGCC-3’，下游为 5’- GGGGTGTCACAATCTGT-3’；GAPDH引物序列:上游为 5’- GATGCTGGTGCCGAGTAC-3’，下游为5’- GCTGAGATGATGACCCTTTT-3’。反应条件:95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s,72 ℃延伸 2 min,总共 35 个循环。用2-ΔΔCt法定量目的基因TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平。

1.3.4 兔房水TNF-α、IL-1β蛋白浓度检测术前由同一实验者取实验组动物术眼及空白对照组动物第一眼房水。术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，取实验组非手术眼及空白对照组第二眼房水。取房水前用聚维酮碘消毒，丙美卡因滴眼液表面麻醉，用30 G针头灭菌注射器，自颞上角膜缘内0.5 mm穿刺进入前房抽取房水0.1 ～0.2 mL。用ELISA法检测房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度。依序测量450 nm波长处光密度(D)值，以TNF-α和IL-1β浓度为横坐标，D值为纵坐标，绘制标准曲线，根据D值由标准曲线查出房水中TNF-α和IL-1β蛋白相应浓度。实验步骤严格按照说明书操作。

1.3.5 角膜知觉敏感度检测于术前及术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，由同一实验者使用Cochet-Bonnet 角膜知觉计(法国Luneau Ophthalmologie公司)测量实验组非手术眼与空白对照组第二眼角膜知觉。角膜知觉计的尼龙纤维长度为0～60 mm，可调节，直径为 0.12 mm。尼龙纤维长度与其施加于角膜的压力呈负相关，即长度越长，对角膜的压力越小。测量前，将兔置于安静室内环境，受检兔清醒，精神状态良好。测量从60 mm开始，测量时将角膜知觉计的尼龙丝垂直于兔角膜中央表面，轻施压力，每次递减5 mm，直至出现被检测眼眨眼及躲避行为作为兔眼角膜知觉阳性反应，同一长度测量3次，每次测量间隔30 min，如果3次检测中出现2次阳性反应视为阳性结果，引起该阳性结果的尼龙纤维长度即为角膜知觉敏感度。

1.4 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。利用单因素重复测量ANOVA及两两比较两组内各取材时间点房水、血清中细胞因子及角膜知觉敏感度差异。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 术后眼前节炎症反应情况实验组25眼手术眼的结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应级别，在术后1 d均为Ⅱ级，术后3 d、7 d为Ι～Ⅱ级，术后14 d降至Ι级，术后21 d恢复至0级。实验组非手术眼与空白对照组双眼在不同时间点，结膜充血、角膜混浊及前房炎症反应级别均为0级。

2.2 两组兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平的变化以两组兔术前血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平为基线值。实验组兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平在手术前后不同时间点差异均有统计学意义(F=272.800、193.530，均为P<0.05)。术后1 d、3 d、7 d、14 d，实验组兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平均较基线值升高，术后7 d达高峰(TNF-α mRNA相对表达量为14.95±0.89，IL-1β mRNA相对表达量为7.56±0.46)，之后逐渐下降，术后21 d降至术前水平。实验组各相邻取材时间点两两比较，血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平差异均有统计学意义(均为P<0.05)。空白对照组各取材时间点，兔血清TNF-α mRNA和IL-1β mRNA表达水平在不同时间点与基线值相比，差异均无统计学意义(F=1.612、0.626，均为P>0.05)(见图1)。

图1 术前和术后不同时间点两组兔血清TNF-α mRNA及IL-1β mRNA表达水平的变化 相同时间点两组相比,*P<0.05

2.3 两组兔房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度变化以实验组术前手术眼、空白对照组第一眼房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度为基线值。实验组非手术眼房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度在不同时间点差异均有统计学意义(F=184.200、82.900，均为P<0.05)。术后1 d、3 d、7 d、14 d，非手术眼房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度均较基线值升高，其中峰值出现于术后7 d[TNF-α蛋白浓度为(162.34±5.71) ng·L-1，IL-1β蛋白浓度为(16.68±0.74)ng·L-1]，之后逐渐下降，术后21 d降至术前水平。实验组相邻取材时间点两两比较，非手术眼房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组第二眼不同取材时间点房水TNF-α和IL-1β蛋白浓度与基线值相比，差异均无统计学意义(F=1.140、0.820，均为P>0.05)(见图2)。

2.4 角膜知觉敏感度变化以实验组术前非手术眼及空白对照组第二眼角膜知觉敏感度为基线值。实验组非手术眼角膜知觉敏感度在不同时间点差异有统计学意义(F=244.910，P<0.05)；术后1 d、3 d、7 d、14 d，非手术眼角膜知觉敏感度较基线值升高，于术后7 d角膜知觉敏感度最高，之后角膜知觉敏感度逐渐下降，术后21 d基本恢复至基线水平。实验组非手术眼相邻时间点两两比较，角膜知觉敏感度差异均有统计学意义(均为P<0.05)。空白对照组第二眼不同时间点角膜知觉敏感度比较，差异无统计学意义(F=1.344，P>0.05)(见表2)。

图2 实验组非手术眼与空白对照组第二眼不同时间点房水TNF-α及IL-1β浓度的变化 相同时间点两组相比,*P<0.05

表2 两组不同时间点角膜知觉敏感度变化

3 讨论

白内障超声乳化吸出术是目前治疗白内障的最有效方法[4]。随着小切口、微切口手术技术的提高及人工晶状体设计方案的不断完善,白内障超声乳化吸出术后患者视觉质量已得到极大提升[5]。然而，关于第一眼白内障术后，第二眼痛觉敏感性增强(痛觉过敏)这一常见问题并未受到临床广泛重视。研究发现[6-7]，双眼白内障患者对首次和第二次白内障手术的主观感觉评估存在差异，第一眼白内障手术后，对侧眼可能存在交感性葡萄膜炎，导致第二眼手术更加疼痛。另有文献报道[8-9]，如果患者在第一眼手术过程中存在对光敏感、术前精神压力大及术后畏光等症状，会导致心理负担加重，进而影响他们第二眼术中对疼痛的感知。

国际疼痛研究学会神经病理性疼痛特别兴趣小组将神经病理性疼痛界定为由躯体感觉神经系统的损伤或疾病所导致的疼痛[10]。近年来，随着分子生物学的研究进展，学者们发现细胞因子 TNF-α、IL-1β除可以诱导白细胞活化、趋化、诱发炎症反应外[11]，在神经系统中还可以作为神经调质增强感觉神经元敏感性，导致神经病理性疼痛(包括痛觉过敏)[12]。正常情况下,TNF-α、IL-1β在中枢神经系统与外周神经系统中的表达很低，神经受损伤后，该细胞因子表达上调，并在神经系统中呈双向转运[13]。当外周神经损伤后，细胞因子逆行转运至中枢，参与中枢部位细胞因子的激活，这是神经病理性疼痛发病机制之一[14]。

Zong等[15]对大鼠坐骨神经慢性缩窄模型(chronic constriction injury model，CCI)进行研究发现，在大鼠脊髓中，TNF-α mRNA在术后表达升高，术后7 d达到高峰，术后14 d已经开始下降，术后21 d恢复至基础水平。此外，CCI大鼠机械缩足反射阈值降低，以术后7 d时最低，之后缓慢回升，术后21 d仍未升至术前水平。Okamoto等[16]测定CCI大鼠坐骨神经中TNF-α mRNA发现，术后14 d TNF-α mRNA表达明显升高，IL-1β mRNA 于术后7 d表达上调，证实其可能参与伤害性信息的传递过程，致敏中枢神经元。Laughlin等[17]研究经腹腔内注射强啡肽诱发的痛觉过敏大鼠模型发现，鞘内应用IL-1β拮抗剂可有效阻止痛觉过敏反应的发生。以上研究结果均证实，在神经系统中，TNF-α、IL-1β可以作为神经调质增强感觉神经元敏感性，导致痛觉过敏。

Fiore等[18]研究发现，当眼睛受到创伤(包括术源性创伤)如白内障摘出术后，创伤眼房水中炎症因子(包括TNF-α、IL-1β)的含量显著增加。TNF-α是将特定炎症与炎症反应联系起来的关键因素[19]，可通过刺激巨噬细胞增加IL-1β分泌。 TNF-α的作用表现出时间和剂量依赖性，其含量可以反映炎症的严重程度。IL-1β生物学效应与TNF-α相似，可引起炎症并诱导炎症反应[20]，诱导TNF-α表达，刺激免疫细胞和基质细胞产生IL-1β，形成恶性循环并加速炎症反应[21]。本研究发现，实验组在第一眼术后1 d、3 d、7 d、14 d，TNF-α、 IL-1β在非手术眼房水及血清中表达均上调，说明手术创伤不仅直接导致术眼的眼内炎症反应，同时，还可导致非创伤眼房水及血清中炎症因子表达上调。

支配眼部感觉的神经是三叉神经眼支。角膜是三叉神经眼支末梢神经分布最为密集的部位，对外界伤害性刺激的敏感性最高。由于在动物实验中，痛觉这一主观感受到目前为止仍无法通过动物表述等方法来直接评价，因此，本研究参考大鼠CCI原理，即通过机械刺激观察大鼠缩足反射来评价其疼痛阈值改变，采用角膜知觉计检测成年兔角膜接受机械刺激后出现眨眼及躲避等行为学表现，获得角膜知觉敏感度，分析其变化规律，进而间接评价眼部痛觉敏感度变化。本研究发现，进行第一眼手术后1～14 d内，兔非手术眼房水中与痛觉过敏相关的TNF-α与IL-1β表达都有明显升高，尤其在术后7 d达到峰值，并且同一炎症因子在血清与房水中的变化趋势呈平行关系。同时，非手术眼在第一眼术后14 d内，其角膜知觉敏感度也较手术前增高，这一变化与TNF-α、IL-1β表达上调存在时程相关性。本研究结果提示我们，导致非手术眼角膜知觉敏感度提高的原因，可能与第一眼手术创伤引起血清及对侧眼房水TNF-α与IL-1β表达上调，继而造成该眼三叉神经感觉支敏感化有关，而三叉神经感觉支敏感化则可进一步导致眼部痛觉过敏。因此，本研究推测患者在第一眼白内障术后，第二眼痛觉敏感性增强，并不只是一个简单的精神心理反应，其中的病理生理学机制可能更为复杂。

本研究结果显示实验兔在第一眼术后2周内，其非手术眼角膜知觉敏感度提高，这对在临床中选择更合适的第二眼手术时机有一定参考意义。然而，有关血清及房水TNF-α与IL-1β表达上调与角膜知觉敏感度变化间的调控通路，及角膜知觉敏感度变化与痛觉过敏之间的内在联系，还需进一步深入研究加以验证。