血管性认知障碍大鼠模型海马损伤的MRI表征

黄明明，魏 琳，曹笑婉，伏 晓，曾邦峰，杨丽铭，余 晖，刘 静

（贵州医科大学附属医院放射科，贵州 贵阳 550008）

血管性认知障碍（vascular cognitive impairment，VCI）是老年人群认知功能障碍最常见的2 种类型疾病之一。脑血管病变是老年人及神经退行性病患者常见的隐匿性疾病，被认为是引起认知功能障碍及痴呆的主要危险因素［1-2］。海马是公认的与认知功能密切相关的脑区，临床研究［3-4］显示，VCI 伴海马萎缩。但目前对VCI 的早期诊断、有效治疗和预后评估一直是医学界面临的难题。动物模型的MRI 研究作为连接疾病临床和基础研究的桥梁，可帮助理解VCI 进程中影像学指标与病理变化之间的联系，将有助于更好地认识VCI 的发生及发展。因此，探讨VCI 早期海马的影像学表现及VCI 引起海马的病理改变具有重要的临床意义。本研究通过建立VCI 的大鼠模型，利用MRI 并结合组织化学染色发现VCI 引起海马损伤的MRI 表征及其病理改变，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 VCI 大鼠模型制作 将30 只体质量约200 g的雄性SPF 级大鼠［购买于贵州医科大学实验动物中心，合格证编号：SYXK（黔）2018-0001］随机分为模型组20 只和对照组10 只，采用改良的Pulsinelli四血管闭塞（4-VO）法模拟全脑慢性缺血。大鼠术前12 h 禁食，4 h 禁水，使用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉（剂量300 mg/kg 体质量）。手术第1 天颈后正中切口，分离出C1两侧翼孔，用电凝针凝闭双侧椎动脉，缝合；24 h 后于大鼠颈部正中切开，钝性分离双侧颈总动脉，并用血管夹夹闭10 min，共3 次，每次间隔1 h。大鼠发生缺血性改变判断标准：夹闭双侧颈内动脉后，皮肤黏膜变为白色，眼球变白，自主活动消失，生命体征存在；放开动脉夹行再灌注时，皮肤黏膜及眼球逐渐变为红色，大鼠可自主活动。对照组重复以上过程，但不行血管处理。

1.2 仪器与方法

1.2.1 MRI 扫描 所有大鼠于造模后2 周、1 个月、3个月、5 个月行MRI 扫描，使用3.0 T 人体扫描仪及小动物专用4 通道相控阵表面线圈。使用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉（剂量300 mg/kg 体质量），并将其头部固定于表面线圈。

T2WI 解剖结构像，扫描参数：TR 5 800 ms，TE 80 ms，视野3.5 cm×3.5 cm，采集矩阵256×128，层厚1 mm，层数20。

1H-MRS 扫描采用单体素PRESS 序列，扫描参数：TR 2 000 ms，TE 40 ms，采集矩阵128×128，视野5 mm×8 mm×8 mm，翻转角90°，激励次数1，扫描时长4 min 52 s。根据大鼠MRI 轴位、冠状位、矢状位T2WI 确定ROI，即双侧海马，尽量避开周围脑脊液等结构。ROI 包含部分皮层及皮层下区域。

1.2.2 学习记忆能力检测 用Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆功能变化，适应性喂养2 周行预扫描。选择T2WI 结构像上大脑实质无明显结构及信号异常的大鼠进行水迷宫实验，主要包括定位航行和空间探索实验两部分。第1～5 天完成定位航行实验，方法：每日将大鼠按1、2、3、4 象限顺序面向池壁从入水点放入水池中，并记录60 s 内大鼠找到固定于第4 象限隐藏平台的时间（即逃避潜伏期）及游泳路径。每只大鼠每天训练4 次，以其4 次逃避潜伏期的平均值作为当日的学习成绩；第6 天完成空间探索实验：撤去位于第4 象限的平台，将大鼠按同样方法放入水中，记录其60 s 内穿过第4 象限原平台位置的次数及第1 次穿过原平台位置的时间。

1.3 数据处理 在T2WI 图像上手动画出代表海马面积的ROI（图1），读出像素个数。所有波谱原始数据导入电脑工作站，应用LCModel 软件进行处理，主要包括N-乙酰天门冬氨酸（NAA）、肌酸（Cr）、肌醇（MI）、谷氨酸（Glu）的浓度。本研究采用NAA/Cr、MI/Cr、Glu/Cr 比值的方法代表各代谢物的含量变化，以消除个体差异。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析。水迷宫数据处理：实验数据以表示，模型组与对照组之间比较采用独立样本t 检验，模型组不同时间点的比较采用重复测量的方差分析，使用Origin 7.0 作图，数据统计分析行两样本t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫实验结果 模型组大鼠术后2 周，即出现学习和记忆能力下降，与对照组大鼠相比，其逃避潜伏期及第1 次穿越平台时间延长，穿越平台次数减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。术后1、3、5 个月，其学习记忆能力持续下降（表1）。

2.2 海马形态的变化 模型组大鼠2 周、1 个月海马面积大小与对照组大鼠相比，差异均无统计学意义（均P>0.05）；但在术后3、5 个月，模型组大鼠海马体积明显萎缩，与对照组大鼠相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05）（图2）。

2.3 海马区域代谢产物的异常 对海马区域1H-MRS的定量分析，发现模型组大鼠海马内存在代谢异常，与对照组比较，术后2 周其NAA/Cr 显著下降、MI/Cr显著升高，一直持续至术后5 个月；此外，Glu/Cr 在术后2 周出现显著下降，术后1 个月下降至最低，而后略有回升（图3）。

2.4 海马区域HE 及Nissl 染色 海马CA1 区锥体细胞排列紊乱、结构模糊，少数神经元呈点状或片状嗜伊红染色增强，似红色神经元。海马锥体细胞胞浆内尼氏体减少、染色减弱，部分锥体细胞胞浆内尼氏体溶解、轮廓模糊着色浅淡（图4）。

表1 Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆功能变化（）

表1 Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆功能变化（）

注：VCI，血管性认知障碍；* 与对照组比较，P＜0.05；# 与VCI 组（2 周）比较，P＜0.05；△与VCI 组（1 个月）比较，P＜0.05；○与VCI 组（3 个月）比较，P＜0.05。

图1 左侧红色曲线勾画出选取海马的解剖位置图2 柱状图显示，从术后3 个月起，海马出现萎缩［红色为对照组，绿色为血管性认知障碍（VCI）模型组］图3 ROI 区（主要为海马大部分）1H-MRS 定量分析统计图 图3a 定位像红色方框显示的是 1H-MRS 波谱所采集的区域 图3b～3d 柱状图分别显示的是随VCI 病程发展，NAA/Cr、Glu/Cr 及MI/Cr（NAA，N-乙酰天门冬氨酸；Cr，肌酸；MI，肌醇）比值的变化图4 术后5 个月VCI 大鼠海马HE 及Nissl 染色图 图4a（HE×100），4b（HE×200） 海马CA1 区锥体细胞排列紊乱、结构模糊，少数神经元呈点状或片状嗜伊红染色增强 图4c（Nissl×100），4d（Nissl×200） 显示海马锥体细胞胞浆内尼氏体减少、染色减弱，部分锥体细胞胞浆内尼氏体溶解、轮廓模糊着色浅淡

3 讨论

本实验采用改良Pulsinelli 4-VO 法制作VCI 大鼠模型，水迷宫实验结果提示，与对照组相比，VCI组在造模后2 周即出现学习和记忆能力下降，表现为逃避潜伏期及第1 次穿越平台时间延长，穿越平台次数减少，证明VCI 模型制作成功。VCI 模型大鼠的学习和记忆能力随术后时间的延长，损害加重，说明此模型引起的全脑慢性缺血性改变可持续造成海马的损伤。

海马是公认的与认知功能密切相关的脑区，临床实验［3-4］显示，VCI 伴海马萎缩，且两侧海马体积明显不对称，左侧海马体积萎缩更明显。动物实验［5］也发现，VCI 动物模型存在明显的海马损伤，海马损伤可导致认知能力的受损，且认知能力下降程度与海马组织受损的体积大小相关。本研究发现，模型组大鼠2 周、1 个月海马体积大小与对照组相比，差异均无统计学意义（均P>0.05），但在术后3、5 个月，VCI 模型组大鼠海马体积明显萎缩，与对照组大鼠相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示海马组织损伤明显；且随时间延长，损伤加重，认知能力下降越明显。

1H-MRS 是目前检测脑内代谢物和生化成分的唯一非侵袭性技术，具有很好的可重复性及稳定性，它可提供神经元的功能、活力、完整性、能量代谢及神经胶质增生等信息［6］。据报道［7］，VCI 患者NAA、NAA/Cr 水平降低，卒中后无认知障碍的患者无神经代谢的改变，但伴认知功能障碍者顶、枕叶NAA 水平显著降低［8］。MI 仅存在于胶质细胞中，其功能和维持神经胶质细胞的体积稳定有关，升高则提示胶质增生［9］。既往研究［7］显示，双侧海马MI 的升高与认知损害程度呈正相关，说明认知损害随海马区神经胶质细胞增生的程度加深而不断加重。在阿尔茨海默病研究［10-11］中发现，轻度认知障碍患者海马MI/Cr 值显著增加，且其敏感程度高于NAA 的降低。本研究也发现，与对照组比较，VCI 模型组大鼠MI/Cr 升高，术后1、3、5 个月大鼠海马MI/Cr 较术后2 周升高，表明VCI 模型组大鼠海马早期即出现神经胶质细胞的增生。

综上所述，VCI 大鼠在术后2 周即出现海马代谢物的异常，主要为NAA 含量的持续降低及MI 含量的持续上升，而在术后3 个月，海马才表现出明显萎缩。因此，推测VCI 大鼠海马内代谢物的改变可能早于海马形态的改变，VCI 大鼠海马NAA 浓度的早期降低和MI 浓度的早期升高可能成为VCI 早期诊断的观察指标。