海带愈伤组织高效诱导体系的研究

刘延岭，李言，姜黎明，田萍萍，彭捷，李晓捷

（山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东省海藻遗传育种与栽培技术重点实验室，山东 烟台 264003）

海带自然分布在高纬度海区，如日本、朝鲜半岛、俄罗斯远东地区沿海[1]，是一种冷温性的大型经济褐藻。多附生在海底岩礁上，是人工栽培生产最多的海藻之一，产量及栽培面积在我国所有藻类中均为第一[2]。根据细胞核、叶绿体和线粒体序列的多基因分析结果，其分类系统隶属于褐藻门（Phaeophyta），褐子纲（Phaeosporeae），海带目（Laminariales），海带科（Laminariaceae），Saccharina 属[3]。海带具有典型的世代交替生活史，大型孢子体世代为二倍体世代，是人工栽培和加工生产的主要对象；配子体世代为单倍体世代，是人工培育苗种的对象。海带孢子体由叶片、柄和固着器三个部分组成。藻体的叶片基部和柄连接地方是生长部，生长部的细胞分裂机能最强。

海藻组织培养从20世纪60年代开始研究，70年代有了海藻组织培养成功的报道[4-5]，80年代以后进展较迅速[6]。海带的愈伤组织给予合适条件，能够重新分化并发育成正常孢子体；同时可以长期保存，通过悬浮培养而迅速增殖，进行无性繁殖育苗。1978年Saga[7]开始研究海带愈伤组织培养，从获得的愈伤组织中分离单个细胞并成功诱导分化形成孢子体，证明了褐藻愈伤组织与高等植物的愈伤组织一样具有全能性[8]。方宗熙等[9]通过对海带与裙带菜不同组织比较，发现叶片生长部和中带部诱导愈伤组织和再分化率最高，柄部次之，假根部最低，柄和假根愈伤组织很难再分化成孢子体。

海藻组织培养在紫菜中发展较成熟[10-11]，而在以海带为代表的我国主要大型经济褐藻中的研究还不够深入，该研究通过对海带愈伤组织诱导过程中不同消毒剂及其时间组合、不同诱导培养基及生长素组合、不同接种外植体部位诱导差异等因素的比较研究，建立了一套海带愈伤组织高效诱导体系，以期为海带细胞工程育种研究提供一种有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

5月，从海区随机选取生长状况良好的新鲜海带，在实验室中用剪刀在生长部剪取大小合适的海带块，用无菌脱脂棉和无菌海水擦拭15～20 min至表面干净无粘液，放到灭菌培养皿中备用。

1.2 培养基和试剂

利用煮沸海水分别配置：MS液体培养基[12]；PESI液体培养基[13]；ESS液体培养基[14]，高压灭菌备用。

利用煮沸海水分别配置：1.5%质量浓度的KI；4%体积浓度NaClO；10%体积浓度H2O2；含有60 mg/L青霉素及100 mg/L环丙沙星的双抗溶液，用一次性针头滤器抽滤除菌备用。

先用1 mol/L的NaOH溶液溶解，再用灭菌一蒸水分别配置：2.0 mg/L的NAA；0.1 mg/L的KT，用一次性针头滤器抽滤除菌备用。

1.3 外植体的消毒

分别使用 1.5%KI、双抗、4%NaClO、10%H2O2四种消毒剂，消毒时间分别为5 min，10 min以及1.5%KI、双抗消毒剂组合进行外植体消毒处理。消毒结束的海带组织，用无菌海水浸泡2次，每次5 min，得到的无菌海带组织放到干净的培养皿中备用。

1.4 不同外植体的选择

用无菌手术刀将无菌海带组织块的边缘切掉，将剩余的组织块切割成5 mm×5 mm大小的块，将一半的组织块放到干净的培养皿中备用，将另一半的组织块两面的表皮切割掉，表皮尽量薄，少带叶肉，将表皮和叶肉单独存放到无菌的培养皿中，然后整块组织、表皮组织、叶肉组织分别接种到PESI液体培养基中培养。培养条件15℃，10 h光照/14 h黑暗，培养观察结果。

1.5 不同培养基的选择

用无菌手术刀将无菌海带组织块的边缘切掉，将剩余的组织块切割成5 mm×5 mm大小的块，接种到MS、PESI、ESS的培养基上，每周更换一次培养基，培养条件15℃，10 h光照/14 h黑暗，定期观察生长状态。

1.6 不同激素组合

用海带表皮组织，表皮尽量薄，少带叶肉，然后分别接种到培养基中培养；诱导培养基分别为不添加激素、添加NAA激素、添加KT激素，添加NAA+KT激素的PESI液体培养基；培养条件15℃、10 h光照/14 h黑暗，培养观察结果。

1.7 数据统计

愈伤组织的诱导率、污染率按下列公式计算：

诱导率=诱导数/未污染数×100%；

污染率=（接种数-未污染数）/接种数×100%。

2 结果

2.1 不同消毒方式的除菌效果

选用了10种消毒方法对外植体进行除菌处理，培养基30 d观察统计结果见表1；由数据可知，1.5%KI+双抗各处理10 min的效果最佳，污染率仅为10%；其次是4%NaClO处理10 min，污染率为13%；第三位是10%H2O2处理10 min，污染率为20%；4%NaClO和10% H2O2对接种材料的伤害较大，组织培养一周观察有腐烂现象，不利于后续的愈伤诱导。

表1 不同消毒方式的除菌效果统计

2.2 不同接种外植体部位对海带愈伤组织诱导的影响

选择了3个外植体部位进行愈伤组织的诱导，分别为整块组织、表皮组织、叶肉组织，经过60 d的诱导培养，诱导率结果见表2；由表中数据可以看出：表皮组织的愈伤诱导率最高，诱导率为88%；其次为整块组织，诱导率为68%；叶肉组织低，诱导率为50%；整块海带组织和表皮组织诱导出了褐色愈伤组织，见图1。

表2 不同接种外殖体对海带愈伤组织诱导的影响

2.3 不同培养基对海带愈伤组织诱导的影响

选择了MS、PESI、ESS三种液体培养基进行海带愈伤组织诱导，经过60 d的培养，诱导情况见表3。由诱导率看出：PESI液体培养基诱导效果最好，诱导率为85%；其次为ESS培养基，诱导率为65%；MS培养基诱导率最低，仅为20%。

表3 不同培养基对海带愈伤组织诱导的影响

2.4 不同激素种类对海带愈伤组织诱导的影响

以表皮组织为接种外植体，诱导培养基分别为不添加激素、添加NAA激素、添加KT激素，添加NAA+KT激素的PESI液体培养基进行愈伤诱导，结果见表4。由结果看出：添加NAA的PESI液体培养基诱导率为85%；添加NAA+KT激素的PESI液体培养基诱导率为83%；添加KT激素和不添加激素的PESI液体培养基诱导率均为80%；KT激素对海带愈伤组织没有明显诱导作用，NAA激素和KT激素这两种激素在海带愈伤组织诱导过程中所起的协同作用不明显。

表4 不同激素种类对海带愈伤组织诱导的影响

3 讨论

海藻组织的无菌处理方式一直不成熟，一方面是由于藻体表面附有大量微生物，其藻体内部也存在一些共生菌，很难做到无菌[15]；另一方面藻体纤弱，高等植物的无菌处理方法不适用。王素娟等[16]在对海藻组织进行消毒试验时也指出，可根据试验需求选择不同的消毒试剂。KI和NaClO处理后的海带染菌率为58.7%，但NaClO氧化性很强，组织块损伤严重，与该文试验结果基本一致，一般不采用NaClO消毒藻体。该试验选用了KI和双抗组合，能达到较好的消毒处理效果。

该试验分别选用了MS、PESI、ESS三种液体培养基对海带组织进行愈伤组织的诱导试验。由试验结果可知，PESI液体培养基对海带愈伤组织的诱导率最高。1992年Notoya[17]研究了用海水PESI培养基加入干酪素来诱导海带愈伤组织的机制。王希华等[18]发现PESI固体培养基诱导海带愈伤组织效果较好，诱导率可达75.5%。该试验发现添加NAA激素的PESI液体培养基更有助力于海带愈伤组织的诱导，诱导率高达85%。

该试验选择接种的外植体部位是消毒处理后的海带表皮组织、叶肉组织和整块海带组织，分别培养，发现组织培养初期均出现透明愈伤组织，培养一段时间后，海带表皮组织的透明愈伤组织逐渐长出褐色愈伤组织；整块海带组织也逐渐长出褐色愈伤组织；而叶肉组织只培养出透明的丝状愈伤组织。观察发现透明愈伤组织可能是由海带的叶肉细胞产生的，而褐色愈伤组织可能是由海带的表皮细胞产生的。Yan等[19]曾报道海带的分化程度低，易诱导产生愈伤组织，并在皮层和髓部形成愈伤组织。

关于激素对海带愈伤组织诱导的影响，Saga等[7]指出 IAA、NAA、2’4-D 等激素对网管藻愈伤组织的诱导没有作用；Yan指出C-751植物合成激素有促进海藻愈伤组织诱导的作用；该试验发现NAA激素对海带愈伤组织的形成有一定的促进作用。

该试验结果表明，以海带生长部的表皮组织作为诱导材料，KI和双抗组合进行消毒，并利用添加激素NAA的PESI液体培养基进行愈伤组织的诱导，取得的诱导效果最好，诱导率高达85%。此诱导体系高效、易操作、结果稳定。该诱导体系的建立为后续进行海带分化育苗等方面的研究提供了试验基础；如果能够利用海带组织诱导培养出的愈伤组织进一步培养分化成苗技术而直接进行海带的苗种培育，将大大缩短海带育苗期，降低生产成本，这将为海带育种提供一种新的途径，具有较高的社会价值和经济价值。