响应面优化羟丙基-β-环糊精对血根碱的包合工艺

梁 浩,钱玺丞,杜晓静,郁建生

(铜仁职业技术学院中兽药重点开放实验室,贵州铜仁 554300)

血根碱(sanguinarine)是一种苯并菲啶型生物碱,主要存在于白屈菜和博落回的全草、紫堇的根、块之中以及血水草的地上部分[1-7]。研究表明其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、改善肝功能等多种药理活性[8-11],广泛应用于生物医药、兽药和饲料添加剂以及生物农药之中[12-17],且血根碱可有效清除自由基保护生物大分子的氧化和羰基化损伤,具有作为天然食品抗氧化剂的潜力[18]。但因其自身理化性质的缺陷,如稳定性较差和水溶性低等因素限制了其在临床上的应用范围[19]。

环糊精包合技术具有提高难溶性药物溶解度增加其稳定性等优点[20],羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)是β-环糊精的羟丙基衍生物,与其母体β-环糊精相比,水溶性更好,在人体中耐受性好,无肾毒性,是一种适用性较广的低毒、安全、有效的药物增溶剂,目前其正在逐步代替其母体,广泛应用于食品和医药等多个领域[21]。

目前关于羟丙基-β-环糊精对苯并菲啶型生物碱的包合作用研究较少,主要集中在对小檗碱的包合作用及包合物性质的研究,对血根碱的包合作用尚未有人报道[22-24]。因此,本试验以羟丙基-β-环糊精为包合材料,将血根碱制成羟丙基-β-环糊精包合物,并通过响应面法优化血根碱包合物的制备工艺,以期增加血根碱的溶解度和稳定性,为进一步拓宽血根碱的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

血根碱 参考文献[25]自制,经HPLC检测纯度为95.1%;血根碱标品(HPLC≥98%) 上海源叶生物科技有限公司;羟丙基-β-环糊精(纯度99%) 上海源叶生物科技有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、浓硫酸等 均为分析纯,购自国药试剂。

Agilent1290超高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司;T10CS紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;CP323C千分之一分析天平 奥豪斯仪器有限公司;CPA225D十万分之一分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司;DF-101S数显恒温集热式磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;FZG-1真空干燥箱 南京华莎干燥设备有限公司;DHG-9030A鼓风干燥箱 上海慧泰仪器制造有限公司;SG5200HE超声波清洗机 上海冠特超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物制备 称取一定量的羟丙基-β-环糊精加入5 mL蒸馏水中,在一定温度下水浴加热,加入血根碱0.1 g,避光水浴搅拌一定时间,之后于40 ℃真空干燥,即得包合物。

1.2.2 血根碱-羟丙基-β-环糊精包合单因素试验

1.2.2.1 羟丙基-β-环糊精与血根碱配比对包合率的影响 在包合时间1 h,包合温度60 ℃的条件下,研究羟丙基-β-环糊精与血根碱不同包合比(1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1 g∶g)对血根碱包合率的影响。

1.2.2.2 包合温度对血根碱与羟丙基-β-环糊精包合的影响 在包合比10∶1,包合时间1 h的条件下,研究不同包合温度(30、40、50、60、70、80 ℃)对血根碱包合率的影响。

1.2.2.3 包合时间对血根碱与羟丙基-β-环糊精包合的影响 在包合比10∶1,包合温度60 ℃的条件下,研究不同包合时间(1、2、3、4、5、6 h)对血根碱包合率的影响。

1.2.3 血根碱与羟丙基-β-环糊精包合试验的响应面分析 以血根碱包合率(Y)为评价指标,在单因素试验基础上,选取血根碱与羟丙基-β-环糊精配比(X1)、包合温度(X2)和包合时间(X3)3个因素,进行3因素3水平的响应面(RSM)设计,实验设计中的水平及编码值见表1。

表1 响应面试验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.4 血根碱含量测定

1.2.4.1 标准曲线绘制 精密称取10.65 mg血根碱对照品置于100 mL容量瓶,用甲醇-1.0%盐酸溶液(50∶50)溶解,并稀释定容,得血根碱标准溶液。精密移取血根碱标准溶液1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 mL于50 mL容量瓶中,加甲醇-1.0%盐酸溶液(50∶50)定容,进行色谱检测。以峰面积Y为纵坐标,浓度X为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程:Y=-3.6454+13.9661X,R2=0.99994,在 0～42.6 μg/mL范围内线性关系良好。

1.2.4.2 色谱条件 检测波长 271 nm;C18色谱柱;进样量 2 μL;流速 0.5 mL/min;0.1%磷酸-乙腈作为流动相;柱温 25 ℃。

1.2.4.3 样品测定及包合率计算 按单因素试验方案和响应面设计方案制备血根碱羟丙基-β-环糊精包合物,称量包合物约10 mg,精密称定,置于25 mL容量瓶中,加1.0%盐酸-甲醇溶液(50∶50)超声溶解,稀释定容,摇匀,过0.45 μm微孔滤膜,制得供试样品溶液。在波长为271 nm条件下采用高效液相色谱法测定,代入标准曲线回归方程计算得到血根碱含量。血根碱包合率(%)=(加入血根碱总质量-包合物中游离血根碱质量)/加入血根碱总质量×100

1.2.5 血根碱包合物的验证 分别配制相同浓度(6 μg/mL)的血根碱溶液、血根碱与羟丙基-β-环糊精混合物溶液、血根碱与羟丙基-β-环糊精包合物溶液、羟丙基-β-环糊精溶液,分别扫描在200～400 nm之间的紫外光谱图。

1.3 数据处理

单因素试验重复测定3次结果采用Origin Pro 8.0 软件进行处理,采用Design-Expert 8.0.6.1对响应面试验结果进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 羟丙基-β-环糊精与血根碱配比对包合率的影响 通过包合比对包合率影响的试验数据显著性分析得P=0.0049达到极显著水平(P<0.01),由图1可知,随着羟丙基-β-环糊精与血根碱包合比的增大包合率随之增大,但到10∶1时血根碱的包合率达到46.5%,之后血根碱包合率随包合比的继续增大,包合率增大不明显,其原因是包合比较小时羟丙基-β-环糊精过少,不足以包合所有的血根碱,当达到10∶1时,羟丙基-β-环糊精对血根碱的包合以达到饱和,因此继续增加羟丙基-β-环糊精的用量包合率增大不明显,从经济方面考虑,选择羟丙基-β-环糊精与血根碱配比为10∶1。

图1 包合比对包合率的影响Fig.1 Effect of inclusion ratio on inclusion rate

2.1.2 包合温度对血根碱包合率的影响 通过包合温度对包合率影响的试验数据显著性分析得P=0.0059达到极显著水平(P<0.01),由图2可知,随温度的上升包合率不断增大,当上升到60 ℃时,包合率达到最大值为46.5%,之后随温度的继续升高包合率开始下降,可能是由于包合过程是一个动态平衡过程,温度较低分子运动缓慢不利于客体分子进入主体分子,温度过高由于分子运动加剧,导致包合物分解[26]。因此选择60 ℃为较佳温度。

图2 包合温度对包合率的影响Fig.2 Effect of inclusion temperature on inclusion rate

2.1.3 包合时间对血根碱包合率的影响 通过包合时间对包合率影响的试验数据显著性分析得P=2.22×10-5达到极显著水平(P<0.01),由图3可知,随着包合时间的增加,血根碱包合率增大,当包合时间3 h时血根碱包合率达到最大值为73.20%,缩短或延长包合时间血根碱包合率均会下降,可能是由于包合过程是客体分子进入主体分子并形成氢键的动态过程,时间缩短包合过程尚未完成,时间延长会导致已经包合的包合物脱离包合[26]。因此选择3 h为较佳包合时间。

图3 包合时间对包合率的影响Fig.3 Effect of inclusion time on inclusion rate

2.2 响应面试验结果

表2 试验设计方案及试验结果Table 2 Experimental design and results

从表3 可知,血根碱工艺参数回归模型的P值=0.0005达到极显著水平(P<0.01),且失拟项P值=0.2030(P>0.05),不显著,方程决定系数R2=0.9584,说明回归方程的拟合度较好,预测值和实测值之间具有高度的相关性,可用于血根碱包合反应的分析与预测。回归方程各项方差分析表明,3个影响因素对血根碱与羟丙基-β-环糊精包合影响的大小顺序依次为:包合时间(X3)>包合比(X1)>包合温度(X2)。

表3 Box-Behnken实验方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Behnken experiment

2.2.2 包合工艺的响应面分析与优化 图4为包合工艺的各因素两两交互作用对血根碱包合反应影响的3D响应曲面图。由图4可看出,包合温度与包合时间的两因素交互作用不显著,包合比与包合温度、包合比与包合时间的两因素交互作用显著。根据响应面分析得到的较佳工艺参数:包合比10.26∶1,包合温度为60.16 ℃,包合时间为3.15 h。在此条件下,血根碱与羟丙基-β-环糊精包合率的理论预测值为72.43%。

图4 两因素交互作用对包合率的影响Fig.4 Each two factors interact on the inclusion rate of response surface map

2.2.3 工艺验证试验 考虑到实际操作的局限性,故将实际提取工艺条件修正为包合比10∶1,包合温度为60 ℃,包合时间为190 min,在修正条件下进行3 次重复验证试验,血根碱包合率平均值达到73.55%,与理论值相对误差为1.5%。由此可见,响应面分析的优化结果与实际值较吻合,说明采用Box-Behnken组合设计优化得到的血血根碱与羟丙基-β-环糊精包合工艺参数准确可靠。

2.3 血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物的验证

利用紫外光谱法[27]对血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物的形成进行验证,结果如图5所示。

图5 血根碱、羟丙基-β-环糊精、两者混合物及其包合物的紫外光谱Fig.5 Ultraviolet spectrum of sanguinarine,β-cyclodextrin,mixtures of the two and their inclusions

不同物质的紫外吸收曲线以及吸收曲线波峰和波谷的位置均有差异,如图5所示,从图中可以看到,血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物的紫外吸收曲线波峰位于324 nm以及269.5 nm,血根碱和血根碱-羟丙基-β-环糊精混合物的波峰位于329 nm和275 nm,因此可判定得到的物质并不是血根碱与羟丙基-β-环糊精的简单混合物,而是血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物。

3 结论

本研究采用溶液搅拌法制备血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物,并通过响应面法对包合工艺进行了优化,结果表明血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物最佳制备工艺为:羟丙基-β-环糊精和血根碱配比为10∶1,包合温度为60 ℃,包合时间为190 min,包合率达到73.55%。经紫外光谱验证,血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物已经形成,本实验通过响应面法优化出的血根碱-羟丙基-β-环糊精包合物的最佳制备工艺稳定、可靠,为血根碱新制剂的研究开发提供了理论依据。