髂股动脉粥样硬化闭塞患者lncRNA ANRIL的表达及其临床危险因素

杨国栋，陈诗强，赵乐

(河南科技大学第一附属医院a.血管外科;b.检验科，河南 洛阳 471003)

髂股动脉硬化闭塞是临床较常见的一种下肢血管性疾病，是在髂股动脉粥样硬化的基础上引起的下肢动脉慢性狭窄闭塞，从而导致下肢的慢性缺血。早期临床表现主要为患侧肢体苍白、冷感，然后出现缺血性疼痛、间歇跛行、肢端溃疡坏疽。该疾病大多合并有心脑血管疾病，治疗风险大，致残率和致死率较高[1-2]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA) ANRIL是一条从染色体9p21.3转录而来的lncRNA，长度为3.8 kb，参与调控血管再狭窄的发生发展，在动脉粥样硬化的进程中不可或缺[3-5]。本研究拟通过观察lncRNA ANRIL在髂股动脉硬化闭塞患者中的表达，分析其在髂股动脉硬化闭塞发生、发展中的作用以及髂股动脉硬化闭塞的临床危险因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2017年3月至2019年8月在河南科技大学第一附属医院接受髂股动脉粥样硬化斑块内膜剥脱术治疗的98例患者的新鲜组织标本，其中稳定斑块组(55例)、不稳定斑块组(43例)以及对照组(36例)。稳定斑块组：男34例，女21例；年龄56～82岁，中位年龄65岁；吸烟者35例，不吸烟者20例；患原发性高血压者23例，无原发性高血压者32例；糖尿病者18例，无糖尿病者37例。不稳定斑块组：男23例，女20例；年龄53～86岁，中位年龄66岁；吸烟者18例，不吸烟者25例；患原发性高血压者20例，无原发性高血压者23例；糖尿病者16例，无糖尿病者27例。对照组(脾脏切除术显示脾动脉正常)：男27例，女9例；年龄43～63岁，中位年龄46岁；吸烟者21例，不吸烟者15例；患原发性高血压者9例，无原发性高血压者27例；糖尿病者6例，无糖尿病者30例。3组患者性别、年龄、吸烟、原发性高血压、糖尿病情况比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。患者自愿参与本研究并签署知情同意书。本研究经河南科技大学第一附属医院医学伦理委员会审批通过。所有入选患者组织斑块标本在离体0.5 h内固定于100 g·L-1的多聚甲醛中，置于-80 ℃冰箱内备用。

1.2 试剂总RNA提取试剂盒购于invitrogen公司，逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自TaKaRa公司，上下游引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3 实时定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测lncRNA ANRIL mRNA的表达采用TRIzol法提取总RNA。严格按试剂盒说明书逆转录合成cDNA。以磷酸甘油醛脱氢酶为内参，反应体系30 μL，条件95 ℃变性10 min，95 ℃ 5 min，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40个循环，72 ℃ 延伸10 min。反应结束后，采用2×SYBR Green PCR Master Mix进行qRT-PCR。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列及扩增产物长度

2 结果

2.1 lncRNA ANRIL的表达lncRNA ANRIL在对照组中的表达量(0.23±0.03)低于稳定斑块组(0.66±0.02)及不稳定斑块组(1.33±0.01)，差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.2 斑块组lncRNA ANRIL的表达与临床因素的关系年龄、性别、吸烟、饮酒均与lncRNA ANRIL的表达无关(均P>0.05)，高血压、糖尿病均与lncRNA ANRIL的表达有关(均P<0.05)。见表2。

表2 lncRNA ANRIL的表达与临床因素的关系

2.3 髂股动脉粥样硬化闭塞独立危险因素的logistic回归模型多因素分析发现，高血压、糖尿病及lncRNA ANRIL表达水平均是髂股动脉粥样硬化闭塞的独立危险因素(均P<0.05)。见表3。

表3 髂股动脉粥样硬化闭塞独立危险因素的logistic回归模型结果

3 讨论

随着中国人口老龄化的进一步加剧及生活水平的提高，动脉粥样硬化所导致的心脑血管意外和外周动脉硬化闭塞等一系列疾病已经严重威胁到居民的生命安全和生活质量。尽管医疗技术的迅速发展使患者经过治疗后症状能够得到缓解，生活质量得到提升，但无法从根本上逆转或阻止其进一步发展。动脉粥样硬化的一个重要发病机制就是血管平滑肌细胞的增殖和迁移，其迁移和增殖导致了血管的狭窄和痉挛，是动脉粥样硬化发生发展的病理基础。

lncRNA是一类长度超过200 nt但不参与蛋白编码过程的RNA[6]。按邻近基因的位置和方向的差异性可以将lncRNA分成基因内、基因间、正义、反义、双向5种类型[7]。lncRNA ANRIL是肿瘤抑制基因INK4b-ARF-INK4a基因簇转录而形成的反义RNA，又称CDKN2B的反义RNA或P15的反义RNA。ANRIL位于染色体9p21.3上不包含任何已知蛋白编码基因的序列上，长度约3.8 kb，含有20个外显子[8]。ANRIL位于INK4基因座上，可转录成与INK4b-AFR-INK4a基因座呈转录反方向的RNA，作用于位于ARF基因转录起始位点上游约300 bps的1个外显子的5’端，从而导致INK4位点的基因沉默，促进血管平滑肌细胞增殖和动脉粥样斑块形成。ANRIL位于内皮细胞、免疫细胞和平滑肌细胞等多种类型的细胞中，在人体内多种正常组织中均有表达。不同组织中ANRIL的表达有差异，尤其在动脉粥样硬化斑块、外周血单核细胞中水平较高[9]。有研究表明，lncRNA ANRIL能够通过调控血管平滑肌细胞引起动脉粥样硬化改变。ANRIL还可通过反向调控靶基因，增加血管平滑肌细胞的增殖、黏附，减少细胞凋亡。

本研究通过qRT-PCR法检测对照组、稳定斑块组和不稳定斑块组中lncRNA ANRIL的表达量，结果显示，lncRNA ANRIL在无斑块组中的表达量低于有斑块组，在稳定斑块组中的表达量又低于不稳定斑块组，即随着斑块的形成及斑块不稳定性增加，lncRNA ANRIL的表达量升高，提示lncRNA ANRIL参与了动脉粥样硬化斑块的形成与发展。Holdt等[10]发现，颈动脉硬化斑块中lncRNA ANRIL的表达量与颈动脉粥样硬化的严重程度呈正相关。全基因组关联研究也表明，位于ANRIL基因的单核苷酸多态性与动脉粥样硬化的易感性密切相关[11]，同时也是冠状动脉相关疾病中遗传易感性最强的位点[12]。ANRIL能招募PRC1和PRC2调节INK4b-ARF-INK4a基因簇的表达，影响心血管疾病的易感性[13]。本研究结果显示，lncRNA ANRIL的表达与性别、年龄、吸烟、饮酒无关，与高血压、糖尿病有关。多因素分析发现，高血压、糖尿病及lncRNA ANRIL表达水平是髂股动脉粥样硬化闭塞的独立危险因素。

总之，lncRNA ANRIL在髂股动脉粥样硬化斑块中的高表达可能促进髂股动脉粥样硬化斑块的形成，这一发现可能为髂股动脉粥样硬化闭塞症的发病机制的研究提供帮助，lncRNA ANRIL的检测有可能成为一个新的诊断髂股动脉粥样硬化闭塞症的标志物。