兔瘟222222222222222222222 型诊断与防控

邵靓 ，丁梦蝶，周莉媛，邓飞，裴超信，陈弟诗，陈亮，周明忠

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041；2.四川省德阳市动物疫病预防控制中心，四川 德阳 618000）

兔病毒性出血症2 型（RHD2）又称兔瘟2型，是由兔出血症病毒2型（RHDV2）引起的危害家兔和野兔的一种新型高度传染性、急性致死性疫病。该病是世界动物卫生组织（OIE）法定通报疫病，我国将其列为二类动物疫病。RHD2自2010 年4 月在法国首次报道后，主要在欧洲国家流行。

1 发病情况及临床症状

某兔场存栏种兔和商品兔约600 只，兔已免兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病二联蜂胶灭活疫苗（YT株+JN株）。商品兔饲养期间出现零星发病死亡，至发病第4 d共计死亡商品兔56只，种兔未见异常。患兔主要表现为精神较差、嗜睡、体温升高，个别兔死前口鼻出血。

2 剖检病变

病死兔气管出血，肺出血、肿大，呈花斑样，肝脏肿大、出血、质脆，脾脏瘀血，边缘梗死，心脏出血、瘀血，肾脏出血、瘀血（见图1）。

3 实验室诊断

图1 剖检病变

3.1 荧光RT-PCR 扩增 分别取4 只病死兔的肝脾等脏器混合研磨匀浆，8 000 r/min 离心2min后取上清，使用磁珠法核酸提取试剂盒和核酸自动提取仪（天隆）进行核酸提取。使用OIE推荐的引物和TaqMan荧光探针对RHDV2 VP60特异性基因片段进行荧光RT-PCR扩增。上游引物序列为5′-TGGAACTTGGCTTGAGTGTTGA-3′，下游引物序列为5′-ACAAGCGTGCTTGTGGACGG-3′，探针序列为5′-FAM-TGTCAGAACTTGTTGACATCCGCCC-TAMRA-3′。荧光RT-PCR扩增反应体系为：RT-PCR 反应液10 μL、RT 酶0.4 μL、Taq 酶0.4 μL、上下游引物各1 μL、探针0.7 μL、2 μL RNA 模板、RNase Free H2O 补足到20 μL。反应条件为：42 ℃5 min，95 ℃20 s；95 ℃10 s，60 ℃40 s（此阶段结束时采集荧光信号），40个循环；报告基团“FAM”，淬灭基团“None”。荧光PCR 仪型号为BIO-RAD CFX96。结果显示，阴阳性对照成立，4 只病死兔肝脾等脏器混合样品在12-16个循环出现扩增曲线，均为RHDV2核酸阳性。

3.2 序列分析 使用OIE推荐的RHDV2特异性引物进行VP60 基因片段扩增，上游引物序列为5′-GAATGTGCTTGAGTTYTGGTA-3′，下游引物序列为5′-CAAGTCCCAGTCCRATRAA-3′，理论上可扩增得到大小为794 bp的特异性条带。RTPCR 反应体系为：2×one step buffer 10 μL、Enzyme mix 0.8 μL、上下游引物各0.5 μL、RNA 模板2 μL、RNase Free H2O补足到20 μL。RT-PCR反应采用一步法，反应条件为：50 ℃30 min，94 ℃2 min；94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃50 s，35个循环；72 ℃5 min。取3 μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，样品在790 bp 处有条带，与理论值相符。

将RT-PCR 扩增产物送测，测序结果进行Blast 序列比对，结果显示所测序列与RHDV2 参考毒株的VP60 部分序列高度同源，其中同源性最高的是荷兰RHDV2 分离株RHDV2-NL2016（GenBank登录号MN061492.1），同源率为96.83%。从GenBank 数据库中下载部分RHDV2和经典RHDV 毒株序列，采用Larsergene 软件MegAlign 进行核苷酸同源性分析，结果显示所测序列与国外公布的RHDV2 毒株VP60 基因片段的核苷酸序列同源性为92.5%～97.6%，用MEGA6软件Neighbor-Joining 法进行遗传变异分析，结果显示所测序列与RHDV2 毒株在同一分支上，亲缘关系较近，而与经典RHDV 毒株的亲缘关系较远。

根据上述序列分析数据，将本次发病兔场家兔组织病料中的RHDV2 毒株命名为SCADCZJ01。

4 防控

确诊后立即开展应急处置，病死兔全部深埋和无害化处理，发病兔和疑似病兔隔离饲养，每天观察2～3 次，兔舍、用具、饲料、饮水及周边环境每天严格消毒2～4 次。禁止出售、转（赠）送、转移活兔及其产品，禁止购进新兔，严禁外来人员入场。

5 小结

兔瘟2 型目前尚无有效治疗药物和疫苗，其与经典兔瘟临床症状相似，故做好该病的诊断与监测是防控的关键。防控兔瘟2 型应加强引种隔离和检疫，最好自繁自养。养兔场应定期消毒和清理粪便等污物，做好灭蚊、灭蝇、灭鼠等工作，种兔和肉兔分点饲养，做好临床观察和记录。发现疑似病兔应立即隔离，并早诊断、早处理。