支气管哮喘患儿长链非编码RNA PVT1的表达及与炎症因子的相关性

薛向东，吴迎爽，马君，程渊博，王利红，韩露

（张家口市第一医院，河北 张家口 075000）

支气管哮喘是儿童最常见的气道慢性、过敏性、炎症性疾病，发病机制仍不清楚，增加了临床诊治的难度，临床急需寻找一种有效的生物标志物用于指导诊治。近年来越来越多的研究表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）这一类不具有蛋白编码功能的核苷酸，在过敏性炎症性疾病的发生、发展中发挥着重要的调控作用，与其参与细胞分化、增殖和凋亡等过程有关[1-2]。与此同时，遗传因素成为近年来国内外学者研究患儿支气管哮喘发病机制的重点，其中浆细胞瘤多样性异位基因1（PVT1）所编码的lncRNA，即lncRNA PVT1 介导小儿支气管哮喘的发病机制，可能是该病的特异性标志物[3]。在体外实验中，JIE 等[4]研究发现，地塞米松处理人类平滑肌细胞后，细胞中lncRNA PVT1 表达水平随之升高，提示lncRNA PVT1 可能参与维持平滑肌细胞表型。宋继波等[5]复制大鼠哮喘模型后，发现造模组lncRNA PVT1表达水平高于对照组。lncRNA PVT1 在患儿支气管哮喘的发病过程中发挥着重要作用，然而表达意义仍不十分明确，尚未形成统一定论，是否与炎症因子有关有待明确。本研究分析支气管哮喘患儿lncRNA PVT1的表达及与炎症因子的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2019年12月张家口市第一医院收治的60 例支气管哮喘患儿作为观察组。其中，男性34 例，女性26 例；年龄3 ～11 岁，平均（6.58±2.37）岁。纳入标准： ①病情处于急性发作期；②符合中华医学会儿科学分会呼吸学组《儿童支气管哮喘诊断与防治指南（2016年版）》[6]；③经医院伦理委员会审批通过，患儿监护人签署知情同意书。排除标准： ①合并先天性心脏病、胸廓病变及免疫功能异常；②长期服用激素或免疫调节剂；③已接受专科治疗。另选同期本院健康体检儿童60 例作为对照组。其中，男性30 例，女性30 例；年龄3 ～11 岁，平均（6.82±2.44）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要实验试剂及仪器

总RNA 提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），逆转录试剂盒（美国GeneCopoeia 公司），白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）试剂盒均购自上海瑞番生物科技有限公司。680 型全自动酶标仪（美国Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

所有受试者入组后，采集清晨空腹肘静脉血5 ml，2 000 r/min 离心分离血清，放置-80℃冰箱待测。按Trizol 法使用总RNA 提取试剂盒提取总血清RNA，采用逆转录试剂盒逆转录为cRNA，采用聚合酶链反应（PCR）检测lncRNA PVT1 表达水平。

收集支气管哮喘患儿和健康体检儿童的气管平滑肌细胞各60 例，并进行原代培养，使用PCR检测lncRNA PVT1 表达水平。正向引物序列： 5'-AATCCTTTATGTGACCAGAA-3'；反向引物序列： 5'-CTCCTTTGTTGAATCCAT-3'，长度20 bp；总反应体系为Mix 10μl，正反向引物各0.8μl，cDNA 2μl，DEPC 水6.4μl；反应条件： 95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，50℃延伸10 s，共计45 个循环。

运用RNA 过表达技术对对照组原代培养细胞进行lncRNA PVT1 过表达，分别收集对照组过表达lncRNA PVT1 前后和观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后的细胞培养上清液，使用酶联免疫吸附试验检测原代培养细胞的炎症因子表达水平，包括IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 观察指标

比较观察组与对照组血清及原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平。观察对照组过表达lncRNA PVT1 前后和观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后原代培养细胞的炎症因子表达水平变化，使用Pearson 法分析不同变量的相关性，使用受试者工作特征（receiver operating curve,ROC）曲线下面积（area under the curve,AUC）评价血清lncRNA PVT1 对支气管哮喘患儿的诊断效能。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验；相关性分析用Pearson 法，绘制ROC 曲线，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清及原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平比较

对照组与观察组血清及原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），观察组高于对照组。见表1。

2.2 对照组过表达lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平比较

对照组过表达lncRNA PVT1 前后原代培养细胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），过表达后高于过表达前。见表2。

表1 两组血清及原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平比较 （n =60，±s）

表1 两组血清及原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平比较 （n =60，±s）

组别 血清 原代培养细胞对照组 0.68±0.26 2.62±0.57观察组 2.85±0.73 13.26±2.84 t 值 5.623 12.045 P 值 0.027 0.000

表2 对照组过表达lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平比较 （n =60，pg/ml，±s）

表2 对照组过表达lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平比较 （n =60，pg/ml，±s）

时间 IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α过表达前 0.35±0.12 4.15±1.26 2.12±0.47 2.87±0.67过表达后 9.62±2.54 42.26±4.71 15.84±2.95 17.41±2.38 t 值 6.528 13.045 8.745 6.364 P 值 0.012 0.000 0.000 0.018

2.3 观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平比较

观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后原代培养细胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），沉默后低于沉默前。见表3。

表3 观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平比较 （n =60，pg/ml，±s）

表3 观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平比较 （n =60，pg/ml，±s）

时间 IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α沉默前 13.84±3.87 58.42±6.38 20.36±4.85 25.47±4.62沉默后 1.06±0.43 4.87±3.91 4.58±1.09 3.62±1.36 t 值 8.424 17.242 12.262 8.942 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 两组lncRNA PVT1 过表达前后或siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平的差值比较

对照组lncRNA PVT1 过表达前后与观察组siRNA沉默lncRNA PVT1 前后原代培养细胞中IL-1β、IL-6、IL-10 及TNF-α 表达水平的差值比较，经t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

2.5 原代培养细胞lncRNA PVT1 与IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平的相关性分析

经Pearson 法分析，原代培养细胞lncRNA PVT1与IL-1β、IL-6、IL-10 及TNF-α 表达水平呈正相关（r=0.225、0.587、0.281 和0.312，P=0.026、0.000、0.021 和0.013）。见图1。

表4 两组lncRNA PVT1 过表达前后或siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平的差值比较（n =60，pg/ml，±s）

表4 两组lncRNA PVT1 过表达前后或siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后炎症因子表达水平的差值比较（n =60，pg/ml，±s）

组别 IL-1β IL-6 IL-10 TNF-α对照组 9.64±2.48 38.45±3.16 13.58±2.68 16.87±3.24观察组 11.07±3.03 46.28±2.98 15.47±2.06 20.16±1.99 t 值 0.879 1.245 0.815 1.364 P 值 0.120 0.087 0.184 0.079

图1 原代培养细胞lncRNA PVT1 与IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平相关性的散点图

2.6 血清lncRNA PVT1 诊断支气管哮喘患儿的效能分析

经ROC 曲线分析，血清lncRNA PVT1 诊断支气管哮喘患儿的AUC 为0.917（95% CI： 93.260，100.000），标准误为0.074，敏感性为75.48%（95% CI： 0.856，0.954），特异性为94.03%（95% CI： 0.934，0.974）。见图2。

图2 lncRNA PVT1 诊断支气管哮喘患儿的ROC 曲线

3 讨论

患儿支气管哮喘的发生、发展与气道慢性炎症反应密切相关，然而具体发病机制并不十分清楚，不利于该病的临床诊治。近年来，遗传因素成为国内外学者研究患儿支气管哮喘发病机制的重点，认为气道平滑肌可能在患儿发病过程中起关键作用。寻找与支气管哮喘患儿气道平滑肌密切相关的特异性生物标志物，有望在解释患儿支气管哮喘发病机制上取得显著进展，指导临床诊治。国外最新研究发现，lncRNA PVT1 不仅参与多种恶性肿瘤的形成，而且可调控机体的炎症反应[7]。WANG 等[8]研究显示，平滑肌细胞中lncRNA PVT1 是维持平滑肌细胞表型的关键所在。AUSTIN 等[9]在动物实验中发现，哮喘组大鼠血清及平滑肌原代培养细胞中lncRNA PVT1 表达水平高于对照组。上述研究均提示，lncRNA PVT1 在患儿支气管哮喘发病过程中的调控作用[8-9]。本研究中，观察组血清及原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平高于对照组，与YANG 等[10]的研究结果相似，提示lncRNA PVT1 在支气管哮喘患儿中表达水平较高，究其原因，考虑为lncRNA PVT1 是一种患儿支气管哮喘遗传易感基因，其是否与细胞因子水平有关，有待商榷。也有研究显示，支气管哮喘患儿血清lncRNA PVT1 表达水平并未较健康体检儿童升高[11]，与本研究结果不同，这可能与血清lncRNA PVT1 表达水平受患儿特应性体质和气道炎症反应影响有关。

现代哮喘理论认为，患儿支气管哮喘的发生、发展有赖于Th1/Th2 细胞免疫失衡所导致的炎症因子高水平表达来实现[12]。炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 可能是导致患儿支气管哮喘症状出现的直接因素[13]。观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 后，原代培养细胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平较沉默前降低，与代冰等[14]研究证实支气管哮喘患者平滑肌细胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 等炎症因子表达水平升高的这一结论相符，提示患儿支气管哮喘与气道炎症反应有关，这可能与免疫调节功能紊乱有关。基于上述研究结果结合笔者临床经验，推测支气管哮喘患儿炎症因子表达水平可能与lncRNA PVT1有关。为验证上述观点，本研究运用RNA 过表达技术对对照组原代培养细胞进行lncRNA PVT1 过表达，结果显示对照组过表达lncRNA PVT1 后，原代培养细胞中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平较过表达前升高；与此同时，对照组过表达前后与观察组siRNA 沉默lncRNA PVT1 前后原代培养细胞中各炎症因子表达水平的差值比较无差异。由此可见，支气管哮喘患儿气道平滑肌细胞中lncRNA PVT1 是调控炎症因子水平的重要因素，两者可能存在某种特定关系。关于出现上述结果的原因，考虑如下： lncRNA PVT1可调控T细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的功能，进而影响炎症因子的分泌和释放[8]，是否仅局限于气道平滑肌，还有待验证。

对于患儿支气管哮喘，分析原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平与炎症因子的关系，有助于支持lncRNA PVT1 调控炎症反应的这一观点。纪易斐等[15]研究认为，lncRNA PVT1 通过促进支气管平滑肌细胞的增殖和迁移，从而上调炎症因子水平。也有研究显示，lncRNA PVT1 不仅促进支气管平滑肌细胞表达和分泌炎症因子，而且通过炎症因子诱导支气管平滑肌细胞增殖和迁移，参与患儿的气道重构[16-17]。lncRNA PVT1如何调控支气管哮喘患儿炎症因子表达和分泌，值得临床学者深入探讨。但在本研究中，笔者通过Pearson法分析，结果显示支气管哮喘患儿气道平滑肌原代培养细胞lncRNA PVT1 表达水平与IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平呈正相关，提示lncRNA PVT1 可能是患儿支气管哮喘的生物标志物，反映炎症反应程度。鉴于支气管哮喘患儿血清lncRNA PVT1 主要来源于气道平滑肌细胞，检测血清lncRNA PVT1 水平，可能为临床诊治支气管哮喘患儿提供依据[18]。本研究的ROC 曲线分析结果显示，血清lncRNA PVT1 诊断患儿支气管哮喘的AUC 为0.917，标准误为0.074，敏感性为75.48%，特异性为94.03%，有效说明了检测血清lncRNA PVT1 水平诊断支气管哮喘患儿的效能较好。

综上所述，支气管哮喘患儿lncRNA PVT1 高水平表达，与炎症因子水平呈正相关，对该病的诊断效能较好，值得临床予以重视。本研究创新点在于初步证实lncRNA PVT1 具有调控支气管哮喘患儿气道炎症反应的作用，为研究患儿支气管哮喘的发病机制提供了新方向。当然本研究亦存在不足之处，如采取单中心研究，样本量不多，缺乏后续诊疗数据，未能分析血清lncRNA PVT1 对患儿支气管哮喘治疗的指导意义，有待日后扩大研究规模，增加样本量，深入分析血清lncRNA PVT1 表达水平与患儿支气管哮喘病情严重程度的关系，以及在该病诊疗中的临床价值。