先天性心脏病患儿术后发生急性肾损伤的危险因素及早期检测血清microRNA-203的意义

熊田辛，查正彪，郑智，郭倩男，陈亮，潘友民

（华中科技大学同济医学院附属同济医院 心脏大血管外科， 湖北 武汉 430030）

先天性心脏病（以下简称先心病）在我国围产儿中的发病率较高，占8‰～10‰[1]。近些年随着心外科手术的日臻成熟，先心病患儿手术成功率也随之提高，但是术后并发症仍然是影响患儿预后最主要的原因，尤其是术后急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）的发生率甚至高达20%以上；且一旦术后发生严重的AKI，迄今为止临床尚缺乏理想的针对性治疗[2]。因此，术后AKI 发生前早预测、合理干预仍然是目前临床改善先心病患儿手术预后、降低病死率的关键。MicroRNA（miRNA）属于一类内源性短链RNA，具有组织特异性、结构保守性等特点，在AKI 发病中扮演着重要角色。

肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1, KIM-1）是目前研究较为成熟的用于诊断AKI的特异性指标[3]，在受损的肾脏组织中高表达，但是无法对AKI 的发生发挥预警作用，而且易受年龄、性别及免疫状态等多种外源性因素的影响。有学者通过细胞实验证实，KIM-1 和miR-203 具有一定的调控作用[4]。本研究对采用改良儿童肾脏疾病风险分级（pediatric risk injury failure loss and end stage renal disease, pRIFLE）。分析接受先心病手术发生AKI 的患儿的临床资料，以探讨AKI 发生的危险因素，以及术后血清miR-235 对AKI的临床预警价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年9月—2018年1月在华中科技大学同济医学院附属同济医院住院的178 例先心病患儿。其中，男性107 例，女性71 例；年龄2 个月～6 岁，平均（4.37±1.42）岁。所有患儿入院后接受先心病体外循环体外直视手术。纳入标准： ①年龄≤6 岁；②术前根据心电图、超声心动图、胸片、常规检查及生物化学检查确诊为先心病，其中57 例患儿为单纯房间隔缺损（atrial septal defect, ASD），53 例患儿为单纯室间隔缺损（ventricular septal defect, VSD），39 例患儿为ASD 合并VSD，29 例患儿为动脉导管未闭（patent ductus arteriosus, PDA）；③术前肾功能正常。排除标准： ①先天性肾功能不全；②住院后造影剂、药物等可能致肾损伤；③心脏衰竭或呼吸衰竭；④48 h 内死亡或资料不全；⑤急诊手术。本研究所有过程遵从赫尔辛基宣言标准，本研究通过医院伦理委员会批准，患儿家属或法定监护人签署知情同意书。

1.2 方法

根据pRIFLE 推荐的AKI 诊断标准[5]： 术后48 h内肌酐清除率（creatinine clearance, CC）较术前降低25%，或尿量＜0.5 ml/（kg·h）≥8 h，将患儿分为AKI 组53 例和非AKI 组125 例。

1.3 主要仪器及试剂

1.3.1 主要仪器Primus 麻醉机（美国Drager 公司），Jostra HL20心肺机（德国Maquel公司），iE33超声仪（荷兰Philips 公司），肝素钠真空采血管（美国BD 公司）。

1.3.2 主要试剂硫酸阿托品注射液（天津金耀药业有限公司，批号： 20160833），丙泊酚（德国Fresenius kabi 公司，批号： 10GF3917），咪达唑仑（瑞士Roche公司，批号： B1297），雷尼芬太尼（宜昌人福药业有限责任公司，批号： 6150314），维库溴铵（浙江仙居制药股份有限公司，批号： 150116），七氟醚（美国雅培制药公司，批号： 7928），酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），Taqman® MicroRNA Reverse Transcription Kit 和Taqman® MicroRNA Assay Kit 试 剂盒（日本TaKaRa 公司）。

1.4 方法

1.4.1 手术方法所有入组患儿采用心脏外科统一标准的麻醉、手术、体外循环和术后监护。术前30 min 肌内注射硫酸阿托品注射液0.1 mg/kg，静脉推注丙泊酚1 mg/kg，待患儿入睡后进入手术室。进入手术室后，开放外周静脉，咪达唑仑0.1 mg/kg、雷尼芬太尼1.0 ～1.5μg/kg 及肌松药维库溴铵0.6 mg/kg 诱导后插管麻醉，咪达唑仑、雷尼芬太尼、维库溴铵及七氟醚吸入维持麻醉，连接Primus 麻醉机行机械通气。正中开胸，体外循环下修补心脏畸形，连接Jostra HL20 心肺机行体外循环。采用iE33 超声仪确定心脏畸形纠正后开始复温，有需要时超滤至血红蛋白（Hb）＞10 g/dl，使用正性肌力药物。血流动力学稳定后中和肝素，关胸后送至儿童重症监护病房。

1.4.2 一般临床资料收集检测所有患儿手术前后肾功能水平、尿量，记录年龄、性别、体重、临床诊断、先天性心脏病手术风险评估共识（the risk adjustment for congenital heart sugery-1, RACHS-1）评分等。记录术中体外循环时间、阻断升主动脉时间、是否多次阻断升主动脉、心肌保护方式[间断性灌注4 ∶1 含血高钾停跳液（以下简称血灌）或全晶体液（Custodial液，以下简称晶灌）]、是否超滤、是否深低温停循环或低流量灌注（低于目标灌注流量的一半以上），以及围手术期血制品用量（包括体外循环预冲及术中、术后）等。

1.4.3 血液标本采集患儿麻醉诱导前和拔管后2、12、24 及48 h 时采集外周静脉血3 ml 置于肝素钠真空采血管（美国BD 公司）中，取上清、分装，-80℃保存备用。

1.4.4 检测指标取血液标本检测Hb、尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、血糖及乳酸。ELISA 检测血液KIM-1 水平，试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4.5 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 检测血清miR-203提取总RNA，根据Taqman®MicroRNA Reverse Transcription Kit 和Taqman®MicroRNA Assay Kit 试剂盒说明书操作，进行逆转录反应。将cDNA 置于-20℃保存备用。按照三步法进行PCR 扩增。以cDNA 为模板，以小分子U6 作为内参，冰浴中配制20μl。PCR 反应条件： 95℃预变性0 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40 个循环，60℃继续循环5 min。根据NCBI 数据库获得的资料设计引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-203 正向引物： 5'-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3'；反向引物： 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，长度97 bp。PCR 结果判断： 根据使用说明调整基线，将阈值设定在荧光值对数图的线性部分，从软件中读取Ct 值。ΔCt=Ct 样品-Ct 内参，ΔΔCt=ΔCt-（Ct 随机阴性对照样品-Ct内参），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 相对表达量。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，比较用独立样本t检验或用重复测量设计的方差分析；计数资料以（%）表示，比较用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线确定目标指标的诊断价值，采用二分类变量Logistic 回归模型分析先心病患儿术后发生AKI 的危险因素，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 先心病患儿术后AKI 发生情况

根据pRIFLE推荐的AKI诊断标准，53 例（29.78%）患儿术后发生AKI，125 例（70.22%）患儿未发生AKI。其中，45 例（84.91%）患儿术后24 h 内发生AKI，8 例（15.09%）患儿术后24 ～48 h 内发生AKI。

2.2 两组患儿术前和术中临床资料比较

两组患儿年龄、术前紫绀型先心病比例、体外循环时间、阻断升主动脉时间、采用血灌进行心肌保护的比例及深低温停循环或低流量比较，经独立样本t检验或χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），AKI 组年龄和采用血灌进行心肌保护的比例低于非AKI 组患儿，而术前紫绀型先心病、深低温停循环或低流量高于非AKI 组，体外循环时间、阻断升主动脉时间长于非AKI 组。见表1。

表1 两组患儿术前和术中临床资料比较

2.3 两组术前和术后不同时间点的KIM-1、miR-203 水平比较

两组术前，以及术后2、12、24 和48 h 的KIM-1、miR-203 水平比较，采用重复测量设计的方差分析，结果： ①不同时间点的KIM-1、miR-203 水平有差异（F=31.864 和39.168，均P=0.000）；②两组 的KIM-1、miR-203水平有差异（F=49.443 和118.218，均P=0.000）；③两组的KIM-1、miR-203水平变化趋势有差异（F=11.153 和24.857，均P=0.00）。AKI 组患儿循环血中KIM-1 水平在术后24 h时达峰值，而miR-203 水平在12 h 时已达峰值。见表2、3。

表2 两组术前和术后不同时间点的KIM-1 水平变化 （±s）

表2 两组术前和术后不同时间点的KIM-1 水平变化 （±s）

组别 n 术前 术后2 h 术后12 h 术后24 h 术后48 h非AKI 组 125 264.75±78.36 268.93±85.17 269.77±86.43 261.36±90.79 254.63±88.31 AKI 组 53 283.01±92.85 300.13±124.98 350.25±81.29 626.36±147.86 581.43±110.71

表3 两组术前和术后不同时间点的miR-203 水平变化 （pg/ml，±s）

表3 两组术前和术后不同时间点的miR-203 水平变化 （pg/ml，±s）

组别 n 术前 术后2 h 术后12 h 术后24 h 术后48 h非AKI 组 125 1.27±0.36 1.28±0.42 1.23±0.48 1.20±0.35 1.25±0.41 AKI 组 53 1.34±0.53 1.82±0.38 2.34±0.39 2.15±0.52 1.97±0.43

2.4 术后2 h 血清miR-203 对先心病患儿发生AKI 的预测能力

ROC 曲线分析显示，术后2 h 血清miR-203 截断值为1.700，其曲线下的面积为0.851（95% CI： 0.775，0.928），敏感性为85.42%（95% CI： 0.825，0.874），特异性为54.17%（95% CI： 0.537，0.587）。见图1。

2.5 AKI 发生的危险因素

以发生AKI 作为因变量（AKI 赋值为1，非AKI赋值为0），将上述差异有统计学意义的变量，包括年龄、体外循环时间、阻断升主动脉时间、术后2 h 血清miR-203 和、KIM-1 表达水平取中位值；以是否为紫绀型先心病、是否采取血灌方式，分别进行赋值作为自变量，采用二分类变量Logistic 回归模型分析先心病患儿术后发生AKI 的危险因素。引入水准为0.05，剔除水准为0.10。结果显示，年龄＜4 岁、紫绀型先心病、体外循环时间＞175.68 min、阻断升主动脉时间＞101.45 min 及术后2 h 血清miR-203＞1.70 是发生AKI 的独立危险因素（P＜0.05）；而血灌心肌保护是发生AKI 的独立保护因素（P＜0.05）。见表4。

图1 先心病患儿术后2 h 血清miR-203 预测AKI 的ROC 曲线

表4 先心病患儿术后发生AKI 的多因素Logistic 回归分析参数

3 讨论

AKI 是先心病患儿术后预后不良甚至死亡的最主要原因之一，发生率为12.5%～71.0%[6]。本研究中共纳入178 例先心病患儿作为受试对象，接受体外循环术后48 h 内有53 例患儿出现AKI 指征，AKI 的发生率为29.78%，这与国内的流行病学资料基本一致。体外循环属于非生理性循环状态，在整个手术过程中，机体血流动力学改变、非搏动性灌注、肾灌注压降低、心内吸引、持续灌注、易造成红细胞损伤和全身炎症反应等都可导致术后AKI 的发生[7]。TODA 等[8]发现，先心病患儿术后发生AKI 的临床特点和危险因素与成人不同，年龄越小，先心病患儿术后发生AKI 的风险越高，这可能是因为患儿年龄越小，机体免疫功能和肾功能尚未发育完全，肾小管上皮细胞等还在继续分化成熟。刚出生的新生儿肾小球滤过率仅为成年人群的50%，1 岁后才能达90%，说明患儿年龄越小，基础肾功能越差。所以纳入的患儿年龄＜6 岁，研究这一高风险年龄段患儿体外循环术后发生AKI 的风险因素更具有临床价值。

本研究中，年龄＜4 岁、紫绀型先心病、体外循环时间＞175.68 min、阻断升主动脉时间＞101.45 min及术后2 h 血清miR-203＞1.70 是发生AKI 的独立危险因素，而血灌心肌保护是发生AKI 的独立保护因素。首先年龄越小，患儿肾功能尚不成熟，可能会影响药物的吸收、分布、代谢和排泄过程，提高肾脏对手术和麻醉制剂的敏感性[9]。除此以外，由于先心病患儿长期慢性缺氧和充血性心力衰竭，出现紫绀的患儿基础肾功能相对较差；而在手术过程中，体外循环和阻断升主动脉时间越长，先心病患儿术后出现AKI 的风险更高。胡秀红等[3]曾提出先心病患者体外循环术前Scr 水平升高是影响AKI 发生的独立危险因素。但是本研究并未发现两组患儿术前Scr 水平有差异，相反两组患儿术前Scr 水平基本一致，这可能和儿童与成人的肾功能差异有关。Scr 属于内生性肌酐，是肌肉中的磷酸肌酸通过不可逆的非酶脱水反应转化而成，通过肾脏排出[9-10]。如果内生肌酐的量相等，Scr 越低则CC 越高，理论上基础肾功能越好[11]。但是内生肌酐量与肌肉含量和质量密切相关，围产儿机体肌肉含量逐渐升高，并不像成人一样维持在较为恒定的范围内，因此不能单纯依靠Scr 水平诊断婴幼儿AKI 的发生。

在前期调研和预实验过程中，笔者发现miR-203是KIM-1 的上游靶基因。本研究也证实，术后2 h 血清miR-203 水平是影响先心病患儿发生AKI 的独立危险因素。KIM-1 是一种敏感性较高的肾功能损伤指标，但是易受年龄、性别、基础疾病及蛋白摄入等多种因素的干扰，最佳诊断效能的时间窗出现在术后12 ～24 h[12]，具有一定的滞后性且敏感性较低，易造成漏诊或误诊。除Scr 外，尿量也属于早期诊断先心病患儿发生AKI 的重要指标，但是婴幼儿的尿液采集较为困难，不适宜作为先心病患儿早期诊断AKI 发生的指标之一[13]。

miRNAs 是真核生物基因中一类非编码的负性调控RNA，可以通过与靶基因3'-非编码区结合抑制RNA 转录[14]，但是miRNAs 在儿科领域的研究尚处于空白阶段。通过XIAO 等[4]的研究发现，KIM-1 与miR-203 的表达量具有一定的调控关系。在肾损伤小鼠模型肾组织中，miR-203 水平降低，并且与基因高甲基化状态有关。但是本研究发现，小儿心脏手术后短期内血清miR-203 呈升高趋势，且在AKI 确诊前，血清miR-203 表达变化较Scr、尿量出现得更早，并且miR-203 水平升高是先心病患儿发生AKI 的独立危险因素，提示可以在早期预测先心病患儿发生AKI的风险。体外循环导致患儿AKI 的原因十分复杂，但是均与急性期炎症反应有关，包括补体活化、细胞因子释放及树突状细胞活化等，例如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）具有直接细胞毒作用，同时降低肾小球血流量和滤过率，刺激炎症细胞浸润。白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）也是导致肾小管损伤的重要因素。而近期LI 等[15]和WANG 等[16]都发现，上调miR-203 水平可诱导内皮细胞炎症反应，同时促进TNF-α 和IL-6 的表达。除此以外，miR-203 能够加速肾小管上皮细胞凋亡，加重肾小管损伤。因此在本研究中，AKI 组患儿术后血清miR-203 水平迅速升高可能与急性期炎症反应密切相关[17]。

综上所述，年龄＜4 岁、紫绀型先心病、体外循环时间＞175.68 min、阻断升主动脉时间＞101.45 min及术后2 h 血清miR-203＞1.70 是先心病患儿体外循环术后发生AKI 的独立危险因素，而血灌心肌保护是发生AKI 的独立保护因素。围手术期应重视对危险因素的干预，以降低先心病患儿体外循环术后发生AKI的风险。除此以外，血清miR-203 有望成为先心病患儿发生AKI 的早期预警分子，但是仍需大样本研究进一步证实。