牦牛屠宰中金黄色葡萄球菌分离菌株的流行特征

屈 云，佟 尧，谈永萍，赵燕英，唐俊妮

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在自然界分布十分广泛，无论是空气、水、土壤等外界环境还是人畜皮肤黏膜表面或排泄物中均可存在，该细菌能引起皮肤、软组织感染，造成食物中毒，以及引起心内膜炎、败血症及中毒性休克等多种疾病症状[1-4]。其致病性主要是通过细菌产生的毒素或侵袭性酶，如肠毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）、表皮脱落毒素、溶血毒素、杀白细胞素、中毒性休克综合征毒素等造成。其中，由SEs基因（sea-selx）编码的多种SEs是引起人类食物中毒的主要毒力因子[5-6]，可与肠道神经细胞受体作用刺激呕吐中枢，导致以呕吐为主要症状的急性肠胃炎[7]；由hlα、hlβ基因编码的溶血毒素，主要损伤红细胞和血小板，破坏溶酶体，引起机体局部缺血和坏死[8]；由eta和etb基因编码的表皮脱落毒素可引起严重的葡萄球菌性烫伤样皮肤综合征[9]；另外，还涉及到由pvl基因编码的杀白细胞素，由tsst-1基因编码的中毒性休克综合征毒素，这些毒素通过不同的作用机制引起宿主一系列炎症和疾病。自20世纪抗生素被发现以来，抗生素不仅是治疗人类细菌感染最有效的药物，而且也作为预防及治疗用特效药、促生长剂、饲料添加剂等被广泛用于畜牧养殖业[10]。抗生素药物的过度使用甚至滥用导致微生物耐药性问题日益突出。近年来，从畜禽养殖和屠宰环节分离的耐药菌株日益增多，耐药菌的存在以及耐药基因的传播、扩散等严重威胁到人类与动物健康[11]。目前，针对牦牛源金黄色葡萄球菌的研究相关文献报道不多，胡萍等[12]针对‘天祝白’牦牛肉和鲜乳中金黄色葡萄球菌及其SEs污染进行分析，发现牦牛乳中金黄色葡萄球菌的检出率为26.67%，牦牛肉中金黄色葡萄球菌检出率为14.70%，说明‘天祝白’牦牛产品中金黄色葡萄球菌污染严重；潘虎等[13]对拉萨市牦牛肉源金黄色葡萄球菌进行鉴定，并对其耐药性进行分析，认为西藏拉萨市牦牛肉源金黄色葡萄球菌携带多种SEs基因，且对青霉素类、大环内酯类和磺胺类等多种抗菌药物产生较强耐药性；李稳欣等[14]对送检病死牦牛的病原进行鉴定，发现牦牛死亡的病原为金黄色葡萄球菌。这些研究表明牦牛源金黄色葡萄球菌污染情况日趋严重，且菌株具有较强的耐药性。因此，应加强对牦牛源金黄色葡萄球菌的监测。本实验于成都市某牦牛屠宰场采集样品后进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定，对细菌携带的毒力基因、耐消毒剂基因以及耐药基因进行检测，并进一步针对分离菌株进行药敏检测，以期为评价牦牛屠宰环节金黄色葡萄球菌安全风险提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

7.5%氯化钠肉汤、Baird-Parker琼脂培养基、1%亚碲酸钾卵黄增菌液、胰蛋白胨大豆琼脂培养基、胰酪胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基、Muller-Hinton琼脂培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司；十二烷基硫酸钠 成都市科龙工试剂厂；Tris饱和酚 北京博奥拓达科技有限公司；无水乙醇 成都海兴化学试剂厂；甘油 天津市瑞金特化学品有限公司；1×TAE电泳缓冲液（由三羟甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸组成）、1×TE缓冲液（由三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸组成）、Regular Agarose-10型琼脂糖 英国Biowest公司；GELVIEW核酸染料、DL2000 Marker 宝生物工程（大连）有限公司；快速聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）混合液（1.1×T3 Super PCR Mix）北京擎科新业科技有限公司；含药纸片 美国Oxiod Limited公司；实验所用基因引物的合成及扩增产物的测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 仪器与设备

DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂；WD800B型微波炉 顺德市格兰仕微波炉电器有限公司；PTC-200 PCR仪、Universal Hood II型凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；SW-CJ-2FD洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；UV-6100分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；GHP-9080水式恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司； HZQ-F160全温振荡培养箱 江苏省太仓市实验设备厂；AKHL-III-24艾柯超纯水机 成都康宁实验专用纯水设备；MLS-3020电热自动灭菌锅日本Sanyo公司；5804R型冷冻离心机 Eppendorf（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

2018年11月于成都市某牦牛定点屠宰场采集屠宰放血后牦牛的鼻腔样本拭子60 份；剥皮后牦牛的肩颈及胸部胴体拭子30 份；屠宰环境样本（屠宰刀具、屠宰接触地面）拭子31 份；牦牛皮毛样本拭子29 份；共计150 份。

1.3.2 金黄色葡萄球菌的分离纯化

金黄色葡萄球菌的分离纯化参照GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[15]进行。

1.3.3 金黄色葡萄球菌的分子鉴定

将纯化的菌株接种到TSB培养基中，37 ℃振荡培养18～24 h，采用文献[16]报道方法提取菌株DNA，金黄色葡萄球菌ATCC6538为阳性参考菌株。以金黄色葡萄球菌的nuc基因引物进行PCR扩增，具体引物序列为：上游引物：5’-AGTATATAGTGCAACTTCAACTAA-3’；下游引物：5’-ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAAT-3’[17]。PCR反应体系20 μL，包含即用型快速PCR混合液（1.1×T3 Super PCR Mix）17 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性20 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；72 ℃延伸2 min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，同时随机选择阳性条带产物进行测序比对。

1.3.4 金黄色葡萄球菌毒力基因、耐消毒剂基因及耐药基因检测

DNA模板制备同上，金黄色葡萄球菌各检测基因的引物序列、扩增片段长度、退火温度详见表1，PCR反应体系同上。

表 1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

续表1

续表1

1.3.5 金黄色葡萄球菌耐药表型检测

药敏实验根据美国临床和实验室标准协会（clinical and laboratory standards in stitute，CLSI）推荐的K-B纸片扩散法进行操作，实验结果按照CLSI的标准进行判定，所用抗菌药物及纸片含量见表2。

表 2 24 种抗生素药物及纸片含量Table 2 Concentrations of 24 antibiotic drugs used in K-B disc diffusion test

1.4 数据处理与分析

药敏实验每株菌和每个药片平行3 次，结果以平均值±标准偏差表示，数据采用SPSS 19.0统计软件处理，采用Excel软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 牦牛屠宰环节金黄色葡萄球菌分离、鉴定结果

金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板的菌落形态为圆形黑色菌落，呈光滑凸起状，表面湿润，菌落周围有透明环。本实验共采集样品150 份，其中，鼻腔拭子样本60 份、牦牛肉胴体样本拭子30 份、环境样本拭子31 份、皮毛样本拭子29 份。通过PCR检测得到携带nuc基因的金黄色葡萄球菌株67 株，总检出率约为44.67%。其中，鼻腔拭子样本检出22 株，检出率约为36.67%；牦牛肉胴体样本拭子检出17 株，检出率约为56.67%；环境样本拭子检出16 株，检出率约为51.61%；皮毛样本拭子检出12 株，检出率约为41.38%。

2.2 牦牛屠宰环节金黄色葡萄球菌分离菌株毒力基因携带情况检出结果

图 1 SEs基因的检出结果Fig. 1 Detection rates of enterotoxin genes

图 2 其他毒力基因的检出结果Fig. 2 Detection rates of other virulence genes

PCR检测结果显示，67 株分离菌株中，传统SEs A-E基因（sea-see）未检出，新型SEs中seg、sei、sej、sek、sem、seo、sep、ser、ses、set、seu、selx共计12 种SEs基因被检出，其中sej、set、seu和selx的检出率较高，selx和seu检出率高达97.01%和91.04%，sej检出率为64.18%，set的检出率为31.34%（图1）。针对其他毒力基因检测结果如图2所示，溶血毒素基因hlα和hlβ的检出率分别为76.12%和38.81%；表皮剥脱毒素基因eta、etb的检出率分别为4.48%、11.94%；杀白细胞素基因pvl的检出率为5.97%，中毒休克征毒素基因tsst-1的检出率为11.94%，所有菌株携带2 种及以上毒力基因。

2.3 金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因携带情况检出结果

图 3 耐消毒剂基因的检出结果Fig. 3 Detection rates of disinfectant resistance genes

如图3所示，耐消毒剂基因qacA/B的检出率为28.36%，qacG、qacH的检出率均较高，分别为70.15%和71.64%；其中qacC/D的检出率最高，达到95.52%。2.4 金黄色葡萄球菌耐药基因携带情况检出结果

图 4 耐药基因的检出结果Fig. 4 Detection rates of drug resistance genes

如图4所示，67 株分离菌株的14 种耐药基因检测结果中，氨基糖苷类耐药基因（aac6’/aph2’）和大环内脂类基因（ermB）的检出率均高达86.57%；其次是blaZ（76.12%）、tetM（64.18%）、mecA（62.69%）、ermA（61.19%）、chlA（50.75%）、tetA（40.30%）、norA（35.82%）和grlA（25.37%）；只有1 株分离菌株携带vanA基因（1.49%），oxa、msrA和mefA基因未检出。

2.5 金黄色葡萄球菌的药敏实验结果

67 株分离菌株对24 种抗生素有不同的耐药谱，如表3所示。金黄色葡萄球菌对克林霉素 （92.54%）耐药率最高，其次是青霉素（8 5.0 7%）、利福平（82.09%）、氨苄西林（77.61%）、左氧氟沙星（71.64%）、四环素（64.18%）、红霉素（62.69%）、甲氧苄啶（55.22%）、阿米卡星（55.22%）、庆大霉素（44.78%）和环丙沙星（40.30%）。对头孢类抗生素头孢西丁（70.15%）、头孢噻肟（65.67%）、头孢曲松（61.19%）和头孢他啶（53.73%）的抗性较强。相较之下，对卡那霉素（2 8.3 6%）、氯霉素（2 2.3 9%）、杆菌肽B（2 2.3 9%）、诺氟沙星（1 6.4 2%）、万古霉素（1 6.4 2%）和呋喃妥因（13.43%）的抗性较低，所有分离菌株对亚胺培南敏感。64 株（95.52%）具有多重耐药性（抗3 种及以上抗生素）。82.09%菌株抗5 种以上抗生素，59.70%菌株抗10 种以上抗生素，9.00%菌株对18 种抗生素有抗性。

表 3 金黄色葡萄球菌对24 种抗生素的药敏检测结果Table 3 Results of antimicrobial susceptibility test to 24 drugs for S. aureus isolates

3 讨 论

本实验从牦牛屠宰场采集样本共150 份，分离出金黄色葡萄球菌67 株，检出率为44.67%，说明牦牛屠宰环节存在较严重的金黄色葡萄球菌污染。现有研究表明其他畜产品中也存在较高的金黄色葡萄球菌检出率，例如谷晓红等[29]在山东地区生鲜乳中金黄色葡萄球菌的检出率为44.62%～64.28%；宋明辉等[30]在市售生鲜肉样品中分离金黄色葡萄球菌，检出率为37.84%。本实验取样的牦牛养殖屠宰场长期处于完全暴露的环境条件下，为金黄色葡萄球菌的生长提供了有利的条件。

本实验牦牛屠宰环节来源的金黄色葡萄球菌携带毒力基因以及抗消毒剂基因的情况较为严重，所分离的67 株菌株共携带12 种SEs基因，尽管传统SEs基因sea-see未检出，但所有菌株都携带2 种及以上毒力基因，说明牦牛屠宰环境分离株具有潜在的致病性。实验结果与刘保光等[31]针对牛奶源金黄色葡萄球菌的毒力基因检测结果有一定的一致性。另外，分离菌株对耐消毒剂基因具有较高的检出率，几乎大多数分离菌株都携带qacC/D基因，携带率最低的qacA/B基因的检出率也达到28.36%。这可能与屠宰环境长期频繁的使用各类消毒剂有关。有学者认为亚洲地区对细菌抗消毒剂基因检出率普遍较高，且发现qacA/B基因检出率明显高于qacC/D基因，认为qacA/B基因是亚洲地区介导消毒剂抗性的主要因素[32]。另有文献报道美洲地区金黄色葡萄球菌的qacA/B的检出率较低（2%），qacC/D检出率（7%）相对稍高[33]。本实验qacC/D基因的检出率远远高于qacA/B基因，这可能与菌株来源不同有关，实验检测的为牦牛源金黄色葡萄球菌，关于牦牛源金黄色葡萄球菌抗消毒剂基因的检测报道不多，以后应加大这方面的研究力度。目前，屠宰企业采用的常用化学消毒剂主要有醛类消毒剂、过氧化物类消毒剂、卤素类消毒剂、酚类消毒剂、季铵盐类消毒剂、复方化学消毒剂等[34]。其中，季铵盐类消毒剂是一种阳离子表面活性剂，其杀灭微生物的机制主要是通过破坏菌体的通透性，使菌体内的蛋白质变性，导致病原微生物死亡。此类消毒剂使用范围广泛，通常可用于畜禽栏舍的喷雾消毒[35]。可见，抗消毒剂基因携带率高低与该地区消毒剂的使用情况可能具有密切关系。

本实验中分离菌株对克林霉素、青霉素、利福平、氨苄西林、左氧氟沙星、头孢西丁、头孢噻肟、四环素、红霉素、头孢曲松、甲氧苄啶、阿米卡星、头孢他啶、庆大霉素和环丙沙星等抗生素的抗性较强，耐药基因检测结果也显示分离菌株携带的7 种耐药基因检出率超过50%，表明牦牛屠宰源分离的金黄色葡萄球菌耐药情况十分严重。这与余璐[36]对食源性金黄色葡萄球菌的耐药分析以及潘虎等[13]对西藏拉萨市牦牛肉源金黄色葡萄球菌耐药分析结果相符。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）逐渐成为多重耐药性金黄色葡萄球菌的代名词，mecA作为MRSA的判定基因，检出率为62.69%，这说明本实验分离出的大部分菌株属于MRSA菌株，存在多重耐药性。与姚咏明等[37]报道金黄色葡萄球菌耐药谱广，耐药性强一致。管程程等[38]认为，金黄色葡萄球菌的耐药机制是由于抗生素、消毒剂的使用不当。有文献报道细菌消毒剂抗性与抗菌药物耐药性存在相关性，并且感染细菌抗性已从抗菌药物扩展到抗消毒剂[39]。由于近年来金黄色葡萄球菌的耐药菌株大幅增加，耐药谱也越来越广泛，提示抗生素、消毒剂合理使用的重要性，以避免细菌的耐药情况进一步加重。实验结果揭示了金黄色葡萄球菌牦牛屠宰环节分离菌株耐药基因、毒力基因的分布和耐药情况，对食品安全风险评估提供参考。