卵巢癌中SMS1对细胞增殖、侵袭和迁移的影响

杭 月，林昌岫，黄成日

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，早期症状不典型，大部分患者就诊时已处于晚期，其中卵巢癌增殖、侵袭和迁移是影响治疗、预后的主要原因[1]。寻找抑制卵巢癌增殖、侵袭和迁移的靶点对于缓解疾病意义重大。神经鞘磷脂合成酶(sphingomyelin synthase, SMS)是神经鞘磷脂(sphingomyelin, SM)合成途径的最后一个酶，在卵巢癌中上调SMS1可诱导T细胞分化后识别卵巢癌细胞表面抗原，促进卵巢癌细胞凋亡[2]，但尚未发现对卵巢癌细胞侵袭和迁移的影响。SMS活性改变与SM、甘油二酯(diacylglycerol, DAG)、卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)、神经酰胺(ceramide, Cer)水平变化有关[3]，SMS活性改变是否因其影响卵巢癌细胞中SM、DAG、PC、Cer水平的变化，从而影响卵巢癌细胞的增殖、侵袭和迁移。本实验通过检测低表达SMS1对卵巢癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响，旨在探讨SMS1与卵巢癌发生、发展的相关性，为卵巢癌的早期诊断及靶向治疗积累临床数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞系 人卵巢癌细胞系HO8910及人正常卵巢上皮细胞系Hose，购自中国上海科学院细胞系。

1.1.2试剂 Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reation, qRT-PCR)试剂盒购自Takara公司；DMEM培养基、胎牛血清购自Invitrogen公司，胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)试剂购自SIGMA公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen公司，PCR仪购自Bio-Rad公司。引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与转染 细胞培养：卵巢癌细胞HO8910复苏后常规培养于DMEM培养基内，(10%胎牛血清、5%CO2、37 ℃饱和湿度)，3～5天待接种细胞生长铺满整个培养瓶底面后，胰蛋白酶消化，传代培养，用于后续实验。细胞转染：根据参考文献[4]及siRNA技术要求，设计针对SMS1的siRNA，采用国际通用与所有基因均无同源性序列的non-target siRNA为阴性对照。将培养至对数期的细胞接种于6孔(5.0×104个/孔)板中，siRNA组为实验组，siRNA-NC转染组为阴性对照组(negative control, NC)，利用Lipofectamine 2000分别转染SMS1-siRNA、siRNA-NC，无转染组为空白对照组(blank control, BC)，转染48 h后，采用qRT-PCR和Western blot法检测细胞SMS1蛋白表达，检测转染效率，筛选稳定表达SMS1的细胞进一步培养。引物序列详见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2MTT法检测细胞增殖 收集转染成功的细胞，接种于96孔板中(1×104个/孔)，重复5孔，每孔培养基总量为200 μL，培养箱内常规培养(5%CO237 ℃)，分别于0、12、24、36、48、60、72 h时，每孔内加入5 mg/mL MTT溶液(每孔为20 μL)继续培养4 h后加入DMSO，利用自动酶标仪于570 nm处检测各孔光吸收值(A值)，绘制细胞活力曲线。

1.2.3划痕实验检测细胞迁移 收集转染后培养至对数生长期的细胞在6孔板中铺板(1×105个/孔)，培养过夜，观察细胞生长情况，单层生长细胞铺满6孔板时，10 μL灭菌移液器头在细胞上垂直划痕，PBS洗去划痕中细胞，加入空白培养基培养，分别在培养0、48 h后选取5个视野，测量细胞中间划痕宽度。

1.2.4Transwell实验检测细胞侵袭 收集转染后培养至对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，离心后加入空白培养基，混匀。Transwell小室上层加入基质胶Matrigel，将细胞在Transwell小室上层铺板(1×105个/孔)，下室预先加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，将Transwell小室放入24孔板内，于细胞培养箱培养24 h后，倒出培养基，PBS冲洗，风干、4%多聚甲醛固定，加入0.14%结晶紫染色，倒置显微镜随机选取5个不重叠视野进行计数并拍照。

1.2.5SMS酶活检测 消化、收集转染成功后细胞，胰蛋白酶消化后匀浆、离心后取上清液，根据参考文献[5]，37 ℃ 5 h，氯仿/甲醇抽提，干燥后，利用薄层层析法检测SMS1酶活。

1.2.6细胞内SM、PC、Cer水平测定 检测细胞内SM、PC：消化、收集转染成功后的细胞，萃取脂质，加入酶显色剂，孵育45 min后，利用自动酶标仪于595 nm处检测吸光度(配制不同浓度SM、PC，绘制标准曲线，根据标准曲线测得吸光度对应的SM、PC浓度)；Cer检测：萃取脂质，加入含有DAG的缓冲液中孵育30 min，利用薄层层析法检测Cer水平。

2 结果

2.1 正常卵巢细胞和卵巢癌细胞中SMS1 mRNA及蛋白的表达卵巢癌HO8910细胞中SMS1 mRMA及蛋白表达水平比正常卵巢细胞显著升高(1.03±0.02vs2.74±0.01，t=187.321，P<0.05，图1)。

图1 正常卵巢细胞、卵巢癌细胞中SMS1 mRNA(A)及蛋白(B)的表达：与正常组相比，*P<0.05

2.2 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞中SMS1 mRMA及蛋白表达量转染48 h后，siRNA(0.47±0.02)组细胞中SMS1 mRMA及蛋白相对表达量较NC组(1.07±0.02)与BC组(1.04±0.01)均显著降低(t=51.962、62.440，P<0.05，图2)。

图2 siRNA-SMS1转染后细胞中SMS1 mRMA(A)及蛋白(B)的表达：与阴性对照组相比，*P<0.05；与空白对照组相比，#P<0.05

2.3 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞内SMS1酶活变化转染48 h后，siRNA组(0.76±0.03)细胞中SMS1酶与NC组(1.04±0.01)、BC组(1.02±0.02)相比，其显著降低(t=21.689、17.664，P<0.05，图3)。

图3 siRNA-SMS1转染后细胞内SMS1酶活变化：与阴性对照组相比，*P<0.05；与空白对照组相比，#P<0.05

2.4 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞增殖siRNA-SMS1转染后siRNA组A570与BC、NC组相比，其显著降低(P<0.05，图4)。

图4 siRNA-SMS1转染后细胞增殖：与阴性对照组相比，*P<0.05；与空白对照组相比，#P<0.05

2.5 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞的迁移和侵袭能力转染后，siRNA组迁移指数、侵袭细胞数与BC、NC组相比，其显著降低(P<0.05，表2，图5)。

2.6 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞中Cer、PC、SM水平转染后，siRNA组HO8910细胞中SM水平与NC、BC组相比，其显著降低(P<0.05)；siRNA组HO8910细胞中Cer水平与NC、BC组相比，其显著升高(P<0.05)；siRNA组HO8910细胞中PC水平与NC、BC组比较，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

图5 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞的迁移、侵袭

表2 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞的迁移和侵袭能力

3 讨论

SMS有SMS1和SMS2两种同工酶，其中SMS1定位于顺面高尔基体，与SM的生物合成有关，SMS1活性对于保持肾乳头收集管细胞中细胞与细胞黏附结构至关重要[6]；SMS1影响膜运输，是细胞增殖和凋亡过程的重要酶[7]。研究发现小鼠胚胎成纤维细胞中，敲除SMS1可抑制胚胎成纤维细胞的增殖[8]；下调SMS1抑制癌细胞增殖从而改善神经胶质瘤患者预后[9]。SMS1水平可影响癌细胞的增殖、侵袭和迁移。本实验结果显示，HO8910肿瘤细胞中SMS1 mRNA及蛋白表达水平高于正常卵巢细胞，在卵巢中可能SMS1水平的升高影响细胞是否发生癌变，对于卵巢癌的检测意义重大。转染48 h后，siRNA-SMS1组卵巢癌细胞中SMS1酶活降低，验证siRNA-SMS1转染HO8910细胞成功。转染siRNA-SMS1后，HO8910细胞增殖能力、迁移、侵袭能力均降低，提示沉默SMS1基因导致一系列信号传导调节细胞增殖分化的作用而抑制，最终实现抑制卵巢癌HO8910细胞增殖，降低其迁移及侵袭能力，但是具体作用机制还有待于进一步验证。

表3 siRNA-SMS1转染后HO8910细胞中SM、PC、Cer水平

SMS1活性改变可能会影响细胞内Cer、PC、SM及DAG等水平变化，进一步影响细胞功能。可催化其底物Cer及PC，生成SM及DAG。Cer、DAG可能与细胞凋亡、老化有关。其中Cer作为体内重要的生物活性物质，可特异性连接细胞外信号转导，参与多种生物学反应[10]。吕勇刚等[11]的研究结果证明，Cer可呈剂量依赖性地促进细胞凋亡，降低细胞存活率；可能作为抑癌脂质，参与细胞自噬调控，导致细胞死亡[12]；Cer可能通过PI3K/mTOR等信号途径参与肝癌[13]、子宫内膜癌[14]等疾病的发生、发展。此外，Cer还可能与细胞迁移、粘连、分化、衰老有关，可能与细胞增殖、侵袭有关[15-16]。SM是组成细胞质、膜的主要磷脂之一，参与调节多种基质蛋白及受体的活动，与信号转导、调控有关，可通过多个信号通路调节细胞凋亡[17-18]，参与肿瘤的发生、发展；水平变化可能与神经细胞增殖、迁移有关[19]。本实验结果显示，HO8910转染siRNA-SMS1后，siRNA组HO8910细胞中SM水平显著降低，Cer水平显著升高，提示沉默SMS1表达使SMS1催化作用减弱，对Cer的作用减弱，对其消耗量减少，导致其在细胞内积累，进而抑制卵巢癌HO8910细胞增殖、侵袭与迁移；同时SM因Cer的催化作用减弱，生成SM的量降低，同样抑制卵巢癌HO8910细胞增殖、侵袭与迁移。

综上所述，SMS1基因沉默后卵巢癌HO8910细胞增殖活性降低，细胞迁移、侵袭能力下降，可能与SMS1基因沉默引起SM水平降低、Cer水平升高有关，本实验初步观察SMS1对卵巢癌表观指标的影响，具体机制有待于进一步分析。