结直肠癌中lipocalin 2的表达及临床病理特征分析

孟晓乐，李 慧，张书铭，王桂梅，唐华美

结直肠癌是全球最常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率在北美和欧洲位居第2位，在中国位居第5位，城市地区比农村高发，并且近年发病率迅速上升[1-2]。尽管手术切除和新辅助治疗改善了部分结直肠癌患者的预后，但转移和复发仍是其预后不良的主要原因[3]。目前结直肠癌的研究主要集中于探索调控其发生和进展的分子靶标。因此，迫切需要深入揭示结直肠癌的分子转移过程，寻找更有效抑制其转移和复发的诊疗靶点。脂质运载蛋白2(lipocalin 2, Lcn2)是lipocalin超家族的成员之一，也称为中性粒细胞明胶酶相关的载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)，相对分子质量为2.5×104，参与运输疏水小分子，如视黄醇和维生素D，并且调节免疫反应、细胞生长代谢、铁转运和前列腺素的合成[4-5]。多种肿瘤如乳腺癌[6-7]、肝细胞癌[8]、食管癌[9]、肾透明细胞癌[10]、子宫内膜癌[11]、结直肠癌[12-13]及神经内分泌肿瘤[14]等均已被发现参与肿瘤发生、进展和转移，表明其可能是恶性肿瘤中潜在的生物学标志物或治疗靶点，而Lcn2在肿瘤发生和转移过程中的功能作用仍存在较大争议。本文主要探讨Lcn2在结直肠癌中的表达及与临床病理特征关系，为临床治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018～2019年福建医科大学附属厦门弘爱医院存档的40例结直肠癌标本，所有患者均未行放、化疗，临床病理资料均完整。新鲜组织标本离体20 min内，快速收集并冷冻于-80 ℃冰箱，术后常规病理活检标本进行切片染色。另收集距肿瘤>5 cm的正常肠黏膜组织作为对照。

1.2 主要试剂RNA 提取试剂：Total RNA Extractor (Trizol)、乙醇(Ethanol absolute)、异丙醇(Isopropanol)购自Sangon Biotech公司，三氯甲烷购自国药集团。反转录试剂盒(Fast King RT Kit)、实时荧光定量PCR试剂盒(SuperReal PreMix Plus-SYBR Green)购自TIANGEN公司。Lcn2正向引物：3′-TC ACCTCCGTCCTGTTTAGG-5′，反向引物：3′-CGAAG TCAGCTCCTTGGTTC-5′；actin正向引物：3′-AAGGT GACAGCAGTCGGTT-5′，反向引物：3′-TGTGTGGA CTTGGGAGAGG-5′，由上海生工生物合成。兔抗人抗体Lcn2/NGAL(ab125075)、鼠抗人β-tubulin(ab6046)购自Abcom公司，山羊抗兔及抗鼠二抗均购自三箭生物公司。组织裂解液RIPA等购自索莱宝公司。Western blot试剂及BCA蛋白浓度定量试剂盒购自Thermo Scientific公司，显色液购自Bio-Rad公司。免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、柠檬酸钠等，均购自福州迈新公司。石蜡组织标本用二甲苯、梯度乙醇等处理。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 将冷冻于-80 ℃冰箱的新鲜组织经液氮冷冻研磨破碎后加入Trizol裂解液获取总RNA，经反转录试剂盒逆转录为cDNA。qRT-PCR检测：每组样品3个重复，以actin作为内参，分别检测癌与癌旁组织，取Ct均值，计算△Ct和△△Ct，最后求2-△△Ct值，即为癌组织的mRNA相对含量。qRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，1.5%浓度的胶，130 V电泳30 min。

1.3.2Western blot法 将冷冻于-80 ℃冰箱的新鲜组织经液氮冷冻研磨破碎后经RIPA裂解，应用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。样品煮沸后进行Western blot电泳。5%的牛奶室温封闭2 h；一抗4 ℃摇床孵育过夜；二抗室温摇床2 h；抗体洗涤液为TBST，每次10 min，合计3次。

1.3.3免疫组化 免疫组化染色采用SP法，标本5 μm厚连续切片，经二甲苯脱蜡；梯度乙醇至水；pH 6.0柠檬酸钠抗原热修复；过氧化物酶阻断；血清封闭；一抗4 ℃过夜；生物素二抗孵育；DAB显色；苏木精复染。免疫组化结果经病理科3名诊断医师评估。根据染色强度评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分。根据阳性染色细胞百分比评分：阳性细胞数<10%为0分，10%～24%为1分，25%～49%为2分，50%～74%为3分，75%～100%为4分。两项结果相乘：0分为(-)，1～4分为(+)，5～8分为()，≥9分为()；其中<5分为低表达，≥5分为高表达。

1.4 统计学分析运用Graph Pad 7.0、Image J进行作图和数据处理，组间比较采用配对t检验，计数资料采用χ2检验及矫正χ2检验统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中Lcn2的mRNA水平应用qRT-PCR法检测Lcn2的mRNA相对含量，actin、Lcn2的cDNA片段长度分别为195、242 bp(图1A)，内参actin基本一致，经相同扩增次数后结直肠癌组织Lcn2的条带更亮，癌旁组织条带较暗。统计分析40例配对样品中Lcn2的相对表达量(2-△△Ct)，癌组织中Lcn2的mRNA水平较癌旁组织明显升高，差异有统计学意义(P=0.006 5，图1B)。

2.2 Western blot法检测结直肠癌中Lcn2 蛋白水平总蛋白进行SDS-PAGE电泳，内参β-tubulin相对分子质量为5.5×104，Lcn2相对分子质量为2.5×104，Western blot法检测结果显示结直肠癌组织内Lcn2蛋白表达均明显高于癌旁组织，且Lcn2/β-tubulin的蛋白相对表达量在结直肠癌组织中升高，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图1 qRT-PCR检测Lcn2在配对结直肠癌组织中的mRNA水平：A.凝胶电泳：1～3.癌旁组织中Lcn2，4～6.结直肠癌组织中Lcn2，7～9.癌旁组织中actin，10～12.结直肠癌组织中actin，13.DNA ladder；B.配对结直肠癌组织中mRNA相对表达量

图2 Western blot法检测Lcn2在配对结直肠癌组织中的表达：A. Western blot分析，N.癌旁组织，T.结直肠癌组织；B.Western blot条带灰度值比

2.3 结直肠癌中Lcn2的表达及与临床病理特征的关系结直肠癌与癌旁组织进行免疫组化染色，高倍镜视下见结直肠癌组织间质中浸润的腺管上皮细胞胞质和胞膜呈棕黄色(图3A)，癌旁组织上皮细胞胞质呈浅棕色或无着色(图3B)。根据免疫组化染色强度与阳性率进行评分，统计分析Lcn2表达与临床病理特征的关系，结果显示：Lcn2蛋白在肿瘤直径>5 cm(100%，P=0.014)、肿瘤分化程度低(92.31%，P=0.017)、T4分期(92%，P=0.042)及无淋巴结转移(92.31%，P=0.025)的患者中阳性率显著升高；与其他临床病理特征均无相关性(P>0.05)。尤其是在肿瘤直径>5 cm、分化程度较低、分期高及无淋巴结转移者，更易出现Lcn2的表达上调(表1)。

表1 结直肠癌中Lcn2表达与临床病理特征的关系[n(%)]

AB

3 讨论

结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，经手术切除和新辅助治疗后患者预后有明显改观，但转移瘤的出现仍然较常见，因此研究肿瘤转移机制中新的标志物或靶标对患者预后具有重大的临床意义。近年研究发现，多种细胞均可表达Lcn2，且可广泛游离于细胞外液和体液中，炎症、缺氧及胰岛素水平变化等刺激可升高其单体、二聚体及复合物的合成和释放；而影响肿瘤进展和转移的关键问题在于：Lcn2启动肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、免疫耐受、血管生成等生物学功能的方式是由内向外还是由外向内发挥作用。部分研究证实Lcn2通过联合表达MMP-9来调节维持细胞高度的凝胶活性作用，促进上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[6,15]。本组免疫组化结果发现在无淋巴结转移的病例中，Lcn2高表达的比例为92.31%，有淋巴结转移仅为57.14%；且无远处转移者Lcn2高表达的比例达79.49%，有远处转移者仅1例，由于标本较少未发现差异有统计学意义。Kim等[12]发现Lcn2具有肿瘤抑制基因的作用，在结直肠癌细胞系中沉默Lcn2可诱导细胞增殖和高度糖酵解，瘤细胞增殖过程中能量需求旺盛伴随有氧糖酵解效应(Warburg效应)并为其提供丰富的营养物质，Lcn2通过能量代谢的重编程负向调控结直肠癌细胞增殖并抑制EMT，与本组实验结果一致。此外，Lcn2抑制肿瘤转移还涉及部分信号通路转导，Feng等[13]发现Lcn2抑制结直肠癌转移是通过减弱NF-κB依赖形式的Snail激活和EMT。值得注意的是，Candido直接通过组织芯片分析原发灶和转移灶内Lcn2的表达，发现转移灶内Lcn2的表达水平明显低于原发灶[16]。曹亚男等[17]报道非小细胞肺癌患者血清中发现Lcn2的表达在骨转移组高于无远处转移组，且骨转移灶内Lcn2表达也高于原发灶。Lcn2表达模式在原发部位和转移部位出现明显分歧，本组病例中发生远处转移者仅1例，其原发灶Lcn2高表达，无远处转移者中有31例原发灶也发现Lcn2高表达(79.49%)，侧面反映出Lcn2在结直肠癌原发灶的高表达模式，对于有远处转移的病例还需进一步扩大样本量和特定转移灶分析。因此，Lcn2在肿瘤进展中的表达模式和功能作用仍然存在较大争议和分歧，尤其是对于肿瘤转移过程中的作用还需要深入研究探索。虽然目前在多种不同肿瘤类型均已表明Lcn2参与肿瘤的发生和进展，但是其转移机制中的作用尚未明确，可能成为肿瘤转移过程中的生物学标志物。

本组结果显示，qRT-PCR和Western blot检测均发现Lcn2在结直肠癌组织中的转录和翻译水平升高，免疫组化结果证实Lcn2在肿瘤组织中高表达，提示Lcn2可能参与结直肠癌的发生和进展。进一步临床病理特征分析发现，Lcn2的表达与肿瘤大小、分化程度、T分期、淋巴结转移均密切相关。但还需要进一步研究其与结直肠癌远处转移之间的关联及预后指标的特异性，深入探讨其在转移过程中的重要功能。

综上所述，本实验结果表明结直肠癌中Lcn2的mRNA和蛋白水平均显著上调，并发现其与结直肠癌的临床病理特征密切相关，提示Lcn2参与结直肠癌的发生和进展，探究其在肿瘤转移过程中的功能仍需要深入分析。