健脾化痰、解毒护肺方干预PM2.5颗粒致肺损伤大鼠的机制及形态学影响

孙熙桐,史锁芳，2*,李玥，胡珀,张慧,朱汇滨,盛倩雯

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023；2.江苏省中医院，江苏 南京 210029；3.南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210023)

近年来，全国各地频现雾霾天气，其主要致病源PM2.5颗粒具有强富集性，可携带有毒有害污染物远距离传输[1]，人体吸入后极易沉积于终末细支气管及肺泡，严重干扰肺脏的气体交换和血液循环，进而诱发气管、支气管炎症反应，导致多种呼吸系统疾病。研究表明，PM2.5颗粒可通过诱导氧化应激反应、炎症反应和免疫异常等多种机制导致呼吸系统损伤[2]。IFN-γ是由Th1细胞分泌的促炎细胞因子,主要介导与局部炎症有关的免疫应答。PM2.5颗粒暴露人群的血清中IFN-γ表达水平较正常人群显著增高[3]。MDA是最常用的脂质过氧化指标之一。江苏省中医院呼吸科主任中医师史锁芳教授在运用中医理论治疗PM2.5所致呼吸系统疾病方面有着丰富的实践经验，总结PM2.5的致病机制并结合多年临证经验，拟定“健脾化痰、解毒护肺方”应用于临床，疗效显著。本研究通过对此方干预PM2.5致肺损伤大鼠模型,探究中医药对PM2.5染毒大鼠肺组织损伤状态及相关炎性因子表达水平的影响，并为中医理论中“正气存内，邪不可干”的治疗思路指导治疗雾霾导致的呼吸系统疾病提供客观依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

清洁级健康雄性大鼠25只，体质量200～250 g[南通大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2014-0001]。购买后在SPF级动物房、维持温度(15±2)℃、湿度(70±2)%环境中适应性饲养1周。将大鼠随机分为5组，分别为空白组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组和西药组，每组各5只。

1.2 仪器设备与试剂

ELX800全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司提供)；Th-150系列智能中流PM2.5环境采样器(武汉天虹仪表有限责任公司)；FDU-1200真空冷冻干燥机(杭州嘉维创新科技有限公司)；CQ-500B型超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂)；LDZ5-2低速自动平衡离心机(北京京立离心机有限公司)；γ-干扰素(IFN-γ)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(海联生物科技有限公司)。

1.3 药物

健脾化痰、解毒护肺方(以下简称雾霾方)组成：炒白术10 g,炙甘草5 g,薏苡仁20 g,桃仁5 g,芦根20 g,冬瓜子15 g,陈皮6 g,瓜蒌皮10 g,皂角刺3 g,桑白皮10 g,苦杏仁10 g,黄芪12 g,桔梗5 g和法半夏10 g;购于江苏省中医院中药房，由实验人员煎取2倍人用剂量(1.41 g生药/mL)浓煎剂。盐酸氨溴索口服液(兰苏)，购于江苏省中医院西药房,临用前由实验人员用双蒸水配制成浓度为7.5%大鼠用剂。

2 方法

2.1 PM2.5的收集与混悬液配制

PM2.5悬液：采样点设于南京市内居民商业街区较高建筑物顶层(16层建筑，约50米高)，时间选择在雾霾天气易发生的下半年，具体时间为2017年8月—2019年1月，期间用Th-150系列智能中流PM2.5环境采样器及聚丙烯滤膜连续采样，滤膜经超声洗脱处理后，收集PM2.5溶液，真空冷冻干燥后-20 ℃保存。根据大鼠的一般生理特性，假设大鼠的潮气量约为c=2.1 mL，呼吸频率约为p=102次/min，暴露人群雾霾天气下暴露时间t=8 h，对应大鼠模型暴露时间一致。根据环境空气质量标准(GB3095-2012)，重度污染下空气中PM2.5颗粒含量为m=250 μg/m3。则每只大鼠每日吸入PM2.5颗粒质量计算公式为M=60 cptm/106(μg)≈26 μg，染毒前用生理盐水配制成浓度为260 μg/mL的PM2.5混悬液。

2.2 动物模型建立

模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组于模型建立当日其经鼻腔滴入配置好的PM2.5颗粒混悬液(0.1 mL/只)，1次/日，持续3周；空白组于模型建立当日起经鼻腔滴入0.9%氯化钠溶液(0.1 mL/只)，1次/日，持续3周。实验周期内每日观察大鼠染毒后的饮食情况、精神状态及活动的变化。造模期间每周及给药结束后分别记录体质量，计算大鼠体质量增长百分率。

大鼠体质量增长率(%)=(实时大鼠体质量-染毒前大鼠体质量)/染毒前大鼠体质量×100%

2.3 给药方法

按照参考文献[4]的药物剂量换算方法，空白组、模型组、中药低剂量组及西药组给药量为10 mL/kg，每只约3 mL，高剂量组给药量为20 mL/kg，每只约6 mL。染毒结束次日，空白组和模型组每日予生理盐水灌胃，每日2次；中药高剂量组予6 mL浓煎剂灌胃，每日2次；中药低剂量组予3 mL浓煎剂灌胃，每日2次；西药组予7.5%的盐酸氨溴索灌胃，每日2次。连续给药9天。

2.4 标本采集与处理

2.4.1 ELISA检测

于末次给药后24 h将各组大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，心脏取血于2 mL离心管中，室温静置1～2 h，离心后取上清并分装，存放于-20 ℃冰箱待用。1周内使用相应试剂盒进行酶联免疫标记，后用ELX800全自动酶标仪读取吸光值并计算结果。

2.4.2 病理学分析

脊椎脱臼法处死大鼠，取新鲜右肺，迅速转移至4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，用切片机将各组组织蜡块切成4 μm厚度切片，HE染色后予中性树胶封片，编号并妥善保存。在光学显微镜200倍视野下观察肺组织病理变化，共观察10个视野，按如下评分标准[5-8]进行肺组织病理评分：1)肺泡腔融合面积占比(a)：无，记0分；0%20%，记3分。2)纤维细胞占比(b)：b≤25%，记0分；25%75%，记3分。3)浆细胞浸润数目：无，记0分；少量，记1分；较多；记2分；显著，记3分。4)肺间质单核细胞数目：无，记0分；少量，记1分；较多；记2分；显著，记3分。5)肺泡壁水肿情况：无水肿，记0分；轻度水肿，记1分；中度水肿，记2分；广泛水肿，记3分。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 一般情况比较

各组大鼠均无死亡。染毒开始后，各组大鼠毛发光泽度未见明显区别，但空白组体型生长速度及活跃程度明显优于各染毒组，整个染毒过程中染毒大鼠均出现鼻尖干裂情况,个别大鼠伴随少量出血，可于3～4 d后自行消失。药物干预后，中药高、低剂量组大鼠体质量增长速度呈恢复趋势，而模型组、西药组体质量增长率并无明显变化。见表1。

表1 不同阶段各组大鼠体质量增长率比较

3.2 肺组织结构变化比较

如图1显示，空白组大鼠肺组织结构相对完整，肺泡分布均匀，总体可见轻度小血管扩张、肺间质有极少量浆细胞及淋巴细胞浸润、极少量纤维细胞增生，肺泡壁断裂及肺泡腔融合不显(A1)。模型组大鼠肺组织呈严重炎性改变，可见明显肺泡间隔增宽、肺间质见大量淋巴细胞、浆细胞浸润，少量纤维细胞增生(A2)。中药低剂量组、西药组大鼠肺组织肺泡结构较完整，可见局部肺泡壁断裂，伴有少量出血和渗出的现象，部分肺间质及支气管周围有炎性细胞浸润及充血(A3、A5)。中药高剂量组肺组织可见明显的炎症反应，肺间质见大量淋巴细胞浆细胞浸润(A4)。肺组织评分比较结果见表2。

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果(×200)

表2 各组大鼠模型肺组织评分比较分)

3.3 大鼠血清中IFN-γ、MDA表达水平比较

与空白组比较，模型组血清中IFN-γ、MDA含量显著上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，中药低剂量组、西药组血清中IFN-γ、MDA含量均有下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；中药高剂量组血清中IFN-γ、MDA含量较模型组降低。见表3。

表3 各组大鼠血清中IFN-γ、MDA表达水平比较

4 讨论

PM2.5颗粒是空气动力学直径≤2.5 μm的颗粒物，最主要来源是煤炭燃烧、机动车尾气、烟草烟雾等，其特征是体积小、重量轻，在大气中滞留时间长，可直接进入肺泡并沉积，并可通过肺泡吸收入血引起氧化应激炎性反应，影响机体特异性免疫反应及非特异性免疫反应，有害成分可随循环系统对人体多脏器产生损伤，对多种疾病发病率、住院率、病死率存在明显影响。PM2.5颗粒可导致一定程度的肺病理变化，主要表现为炎性改变：支气管炎、支气管扩张、间质淤血水肿、间质炎性细胞浸润和肺纤维化肺组织形态学改变[9]。因此肺组织形态学改变可以直接反映PM2.5颗粒对呼吸系统的病理影响，是探究中药对雾霾所致呼吸系统疾病疗效的重要依据。

IFN-γ是由Th1细胞分泌的促炎细胞因子,主要介导与局部炎症有关的免疫应答,是创伤或感染后机体最早产生的多功能细胞因子之一,能显著增加肺单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等MHCⅡ类抗原的表达,增强抗原递呈细胞与T细胞的相互作用,使细胞毒性T细胞功能增强,导致肺组织细胞损害[10]。此外，IFN-γ不仅可直接作用于肺组织细胞及血管内皮细胞,还可以诱导同样能直接损伤肺血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞的TNF-α因子的表达[11]，同时又诱导内皮细胞和巨噬细胞释放IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子，进而再度激活炎症效应细胞，扩大炎症反应[12]。大鼠体内IFN-γ因子的表达水平是反映PM2.5颗粒对肺组织损伤机制的重要指标。

MDA是脂质过氧化的重要产物之一，可作为氧化应激的标志，由活性氧降解多不饱和脂肪酸而生成[13]。在肺损伤发展过程中，氧自由基的释放可产生大量脂质过氧化物，破坏细胞的膜性结构，增加肺泡上皮细胞及肺泡毛细血管内皮细胞的通透性，促进肺水肿的发生[14]。检测药物干预前后PM2.5大鼠模型体内MDA水平，对探究雾霾方对PM2.5大鼠模型的干预机制具有重要意义。

本研究显示，造模后，模型组大鼠肺组织病理改变显著，血清中IFN-γ、MDA水平显著升高，这表明PM2.5所致大鼠肺损伤过程中可释放大量氧自由基，产生大量脂质过氧化物，同时刺激TH1细胞分泌IFN-γ，进一步“级联放大”炎症信号，导致肺组织细胞损害，同时说明PM2.5混悬液鼻腔滴注法可成功建立PM2.5所致肺损伤模型。中药低剂量组与模型组比较，肺组织评分、IFN-γ水平、MDA水平均显著降低，说明雾霾方可以通过降低IFN-γ的表达而抑制染毒大鼠体内的炎症反应；同时可以初步推断，本方可以通过增强肺组织的抗氧化能力减少氧化应激反应，抑制脂质过氧化物的产生，从而减轻PM2.5颗粒对肺组织的损伤作用。其中中药高剂量组的IFN-γ、MDA的水平较模型组虽有降低，但差异无统计学意义，说明不同剂量的中药治疗组对PM2.5所致大鼠肺损伤均有一定影响，但具体的量-效关系需进一步研究。

中医学认为，PM2.5为代表的雾霾污染属于“浊毒”范畴，是外邪的侵袭，能够损伤人体肺卫功能，在体内产生病理产物，进一步对其他脏腑产生影响[15]。《黄帝内经》曰：“正气存内，邪不可干”，采用中医药预防性治疗PM2.5接触患者，将有益于提高该部分群体的环境适应能力，加强机体排毒解毒功能。江苏省中医院呼吸科主任医师史锁芳教授经长期临床实践，认为雾霾(PM2.5)作为“浊毒”侵害人体，可在体内进一步形成痰湿、瘀毒；易感人群辨证属肺脾气虚。在动物实验中，以中医理论剖析“雾霾大鼠模型”实为“痰湿碍脾、浊毒伤肺”之证，脾胃运化功能失常，因而模型大鼠可见明显的生长减缓，与中医理论相符。因此，拟“健脾化痰、解毒护肺方”，意在用健脾润肺法扶土生金以固本，兼顾化痰祛湿解毒而治标，可恢复脾脏运化、肺之宣肃。方中桑白皮清泻肺热，黄芪、白术益气健脾，薏苡仁、冬瓜子、法半夏除湿化痰，桔梗、苦杏仁理肺祛痰止咳，芦根、瓜蒌皮润肺利咽，桃仁、陈皮、皂角刺理气活血、祛瘀解毒，炙甘草调和药性，诸药合用，可收扶助正气、祛除浊毒之功，为中医药防治PM2.5诱发症研究开辟了新的研究思路。