基于解烃菌对含蜡原油除蜡降黏的实验分析

鲍天宇，王卫强，罗 超，贾宇童，李 阔

（辽宁石油化工大学石油天然气工程学院，辽宁抚顺113001）

我国的含蜡原油储量非常丰富，据统计90% 原油蜡质量分数在20%~40%[1]。含蜡原油在运输过程中，当温度降低至原油析蜡点时，原油中的蜡晶结晶析出,进而以管壁粗糙凸起处为结晶中心聚集，形成蜡沉积[2⁃3]。输油管道结蜡后导致含蜡原油的黏度增加，管道流通面积减小，流动阻力增加，致使含蜡原油输送效率降低[4]。甚至当管壁结蜡达到一定程度时会堵塞管路，直接影响含蜡原油生产，造成间接经济损失[5]。目前国内常用的含蜡原油输送方式有加热输送、稀释输送、添加化学药剂输送等[6]，但这些方法均有自身不可克服的缺陷。

微生物清防蜡技术通过微生物自身活动来降解含蜡原油中大分子结构烃类（长碳链烃），从而打破含蜡原油中大分子聚合结构（降解为短碳链烃），减少重质组分，降低含蜡量[7]。利用微生物法对含蜡原油进行有效的除蜡降黏，可改善含蜡原油流动性，最终保证含蜡原油的正常生产，管线正常输送，大幅降低管输费用[8]。

针对大庆含蜡原油特点，从被大庆原油污染的土壤中挑选出一株解烃菌，对其除代谢产物性能及除蜡降黏效果进行研究。

1 实验部分

1.1 培养基成分

LB 培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂粉10 g/L，纯水1 000 mL，pH 7.0。

无机盐培养基：纯水1 000 mL，NaCl 5 g/L，（NH4）2SO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，KH2PO45 g/L，K2HPO45 g/L，NaNO32 g/L，液 体 石 蜡2 mL，pH 7.0~7.2。

1.2 实验油样

实验油样来自于大庆油田，蜡质量分数为17.5%，在37 ℃条件下表观黏度为2 862 mPa·s。

1.3 实验仪器

恒温水浴振荡器（江苏金坛市环宇科学仪器厂）；生化恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；紫外分光光度计（上海科恒实业发展有限公司）；pH 计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；离心机（日本HITACHI）；JJ2000B 型旋转滴界面张力测量仪（上海中晨数字设备有限公司）；Q2000 DSC 差示热量扫描仪（美国TA 梅特勒⁃利托多公司）；HAKEE 流变仪（上海珩璟科技有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 菌株筛选 将5 g 大庆油田油污土壤加入100 mL 无机盐培养基中，放入恒温水浴振荡器中培养至溶液浑浊（振荡条件为37 ℃、150 r/min），取1 mL 培养基上清液转接到新鲜100 mL 的无机盐培养基中，在同等条件下培养至溶液浑浊，如此反复转接5 次，得到解烃菌菌液，然后取100 μL 菌液均匀涂布到LB 固体培养基上，放入生化恒温培养箱中培养，再用接种环挑取单菌在新鲜LB 固体培养基上划线纯化，最终得到纯化后的解烃菌。

1.4.2 解烃菌生长环境优化 对该菌在不同温度、pH、转速条件下优化其生长环境。

光密度值测定：将纯化后的解烃菌菌液以5%接种量(体积分数，下同）接到无机盐培养基中，分别在30、32、34、36、38 ℃进行培养，通过紫外分光光度计在波长为600 nm 处测定菌液光密度值。

pH 测定：利用pH 计将培养基pH 调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，菌液光密度值测定方法同上。

转速测定：将摇床转速分别调至90、120、150、180、210 r/min，菌液光密度值测定方法同上。

1.4.3 解烃菌代谢产物性能分析 将菌株以5%接种量种于100 mL 无机盐培养基中，并增设不加菌为对照，在37 ℃、150 r/min 条件下振荡培养7 d。

乳化性能分析：采用离心机离心去除菌体[9]，得到无菌上清液，取4 mL 无菌上清液与4 mL 液体石蜡混合后,通过涡旋振荡器振荡2 min，在室温条件下放置24 h 后测定乳化层高度，乳化高度值与总高度值之比即为乳化指数。

界面张力测定：采用离心机离心去除菌体，得到上清液，通过界面张力仪测定液体表面张力[10]。

排油活性测定：采用离心机离心去除菌体，得到无菌上清液，取60 mL 无菌水倒入直径为15 cm的无菌洁净平板中，并在表面滴1 mL 液体石蜡形成油膜，滴一滴无菌上清液，观察排油现象，并测量排油圈直径大小。

1.4.4 解烃菌除蜡性能分析 将菌株以5% 接菌量接入100 mL 无机盐培养基中，并加入40 mL 大庆含蜡原油（蜡质量分数为17.5%，密度为873 kg/m3，37 ℃表观黏度为2 862 mPa·s），在37 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d 后，利用Q2000 DSC 差示热量扫描仪测定经解烃菌菌液处理前后的大庆油田油样中蜡质量分数。在测量前，使用电子天平准确称取4 ~6 mg 油样放入坩埚中，将坩埚盖盖好压紧放入仪器中，通过差示扫描量热仪测定含蜡原油蜡质量分数、析蜡点、析蜡高峰点等参数变化，得到DSC曲线，放热峰的内插基线与DSC 曲线包围的峰面积即蜡晶放热量，采用式（1）对原油蜡质量分数进行计算[11]。

式中，TC为热谱线偏离基线对应的温度，℃；dQ 为蜡释放出的热量，J/g；-Q 为蜡的平均结晶释放热，J/g。

1.4.5 解烃菌降黏性能分析 将菌株以5% 接菌量接入100 mL 无机盐培养基中，并加入40 mL 大庆含蜡原油（蜡质量分数为17.5%，密度为873 kg/m3），在37 ℃、150 r/min 条件下振荡培养7 d 后低速离心脱水，通过流变仪测量经解烃菌作用前后含蜡原油黏度变化[12]。

2 结果与分析

2.1 菌株生长环境优化

通过紫外分光光度计测得该解烃菌在不同温度下的生长曲线如图1 所示。由图1 可见，解烃菌的活性强度随温度变化呈现出先增高后降低的趋势，当温度较低时，解烃菌细胞内酶的活性随之下降，使物质代谢过程中各种生化反应速度减慢，因而解烃菌的繁殖速度也随之减慢；相反，当温度过高时，解烃菌的生长也遭到抑制。所以，确定较佳生长温度为36 ℃。

图1 不同温度下解烃菌生长曲线Fig.1 Growth curve of hydrocarbon⁃solving bacteria at different temperatures

紫外分光光度计测得该解烃菌在不同pH 条件下的生长曲线如图2 所示。由图2 可见，解烃菌在pH 6.0~8.0 的活性都是先增高后降低。随着pH 的升高，解烃菌生长受阻，当超过最适pH 时，引起解烃菌的死亡。确定pH 为7.0 时，解烃菌表现出良好的生长特性。

图2 不同pH 下解烃菌生长曲线Fig. 2 Growth curve of hydrocarbon⁃solving bacteria at different pH values

紫外分光光度计测得该解烃菌在不同摇床转速（90~210 r/min）条件下的生长曲线如图3 所示。由图3 可以看出，摇床的转速太高和太低都不适宜解烃菌生长，当摇床转速为90 r/min 时，解烃菌生长量不高；当转速为210 r/min 时，解烃菌生长速度慢，确定解烃菌最佳的摇床转速为150 r/min。

2.2 代谢产物性能分析

排油活性测定：通过观察细菌代谢产物形成的排油圈(见图4)可以看出，在水面上形成的油膜在表面活性物质作用下从油膜中心向四周排挤，在中心形成一块清洁圆形区域，测得其直径为7.7 cm。中心圆形区域的大小与代谢产物的表面活性有关，中心区域圆形直径越大，活性强度越高，这表明该菌代谢产物表面活性强，有利于细菌降解。

图3 不同摇床转速下解烃菌生长曲线Fig. 3 Growth curve of hydrocarbon⁃decomposing bacteria at different rotating speeds

图4 发酵液排油活性检测Fig. 4 Detection diagram of oil removal activity of fermentation broth

乳化指数测定：乳化指数是微生物清防蜡的一个重要指标[13]。微生物在以石蜡为碳源进行新陈代谢时，会产生一些表面活性剂，这类表面活性剂与石蜡混合后会产生乳化作用，乳化作用会增加石蜡在液相中与烃类物质的接触表面积，从而提高细菌对石蜡的降解[14⁃15]。测得本实验乳化层高度为5.7 cm，乳化指数为71%，而对照组未产生乳化，说明该解烃菌产生的代谢产物具有较强的乳化性能，可促进细菌对石蜡的降解。

界面张力测定：采用离心机离心去除菌体，得到无菌上清液，通过界面张力仪测定液体表面张力变化[16]。测得对照组界面张力为78.34 N/m，实验组的界面张力为39.49 N/m，表明该菌株代谢产物具有降低界面张力的作用，界面张力的降低有利于石蜡在液相中的溶解度，界面张力越低，石蜡在液相中越易溶解，细菌能更好吸收利用，可促进细菌对石蜡的降解。

2.3 解烃菌除蜡性能分析

利用Q2000 DSC 差示热量扫描仪对经解烃菌菌液处理前后大庆油田油样蜡质量分数、析蜡点和析蜡高峰点进行测定，结果如图5 所示。

图5 解烃菌处理前后大庆含蜡原油差示热量扫描Fig. 5 Differential heat scanning of waxy crude oil in Daqing before and after treatment with hydrocarbon bacteria

从图5 可以看出，大庆含蜡原油未经菌株处理的结晶放热值为36.79 J/g，蜡质量分数为17.5%，析蜡点为46.93 ℃，析蜡高峰点为22.80 ℃；而经菌株处理后，结晶放热值为16.70 J/g，原油蜡质量分数为8.0%，析蜡点为44.80 ℃，析蜡高峰点为21.93 ℃。从以上结果分析得到，含蜡原油在经菌株作用7 d 后，原油蜡质量分数、析蜡点以及析蜡高峰点均产生了显著变化。原油蜡质量分数的降低可降低含蜡原油输送管道的结蜡程度，而析蜡点以及析蜡高峰点的降低表明该菌株在一定程度上可起到防蜡的作用[17⁃18]。

2.4 解烃菌降黏性能分析

含蜡原油经菌株在最优环境下作用7 d 后，通过流变仪测得原油黏度变化如图6 所示。从图6 中可以看出，含蜡原油经菌株处理后，非牛顿流体黏度下降较为显著，反常点由53 ℃降为50 ℃。这表明该菌株通过除蜡降低了原油黏度，改善了流动性，可大幅降低含蜡原油管输费用[19]。

图6 解烃菌处理前后原油黏温曲线Fig. 6 Crude oil viscosity⁃temperature curve before and after treatment by hydrocarbon⁃decomposing bacteria

3 结 论

（1）在室内条件下，从被大庆原油污染的土壤中筛选出一株解烃菌。该菌种在36 ℃、pH 7.0、摇床转速150 r/min 的培养环境下，生长状况较好。

（2）经实验测得，该解烃菌代谢产物性能乳化指数为71%，具有较强的表面活性和排油活性，可使液体表面张力从78.34 N/m 降低到39.49 N/m，在一定程度上增强蜡的溶解。

（3）含蜡原油经解烃菌处理后，蜡质量分数降低54%，析蜡点降低2 ℃，反常点降低3 ℃，黏度降低15%，有效改善了大庆原油的流动性，适用于一定条件下含蜡原油的开采及输送，为输油管道清防蜡提供了另一种方法。