香榧花粉活性检测及离体培养条件筛选

任少华，张驰强，王 陈，周鑫伟，康 立，周 庆，龙成昌

(贵州省植物园，贵阳 550004)

香榧(TorreyagrandisFort.et Lindl.cv.Merrillii)红豆杉科榧树属常绿乔木，系中国特有树种。榧树属在中国有3个种、2个变种，即巴山榧(Torreyafargesii)、云南榧(Torreyafargesiivat．yunnanensis)、榧树(Torreyagrandis)、九龙山榧(Torreyagrandisvar.fiulongshanensis)、长叶榧(Torreyajackii)，香榧是榧树属中唯一性状稳定实行人工栽培的优良品种。香榧适温暖湿润、凉爽多雾的气候与肥沃深厚、排水良好的酸性或微酸性土壤，寿命长，其种子含大量营养元素，是中国著名干果，也可药用[1]；树冠整齐，姿态优美，可做庭园观赏优良树种；根系发达，抗旱能力非常强，可作为水土保持的重要林木品种[2]。

香榧属裸子植物，在其生活史中有性生殖是非常重要的环节，而在这个过程中传粉受精又是关键点。花粉是高等植物的雄性配子载体，在有性生殖过程中传递雄性亲本的遗传信息。植物的基因型多包含在植物花粉中，而花粉活性对植物的育种成功有重要影响，直接影响植物体自然或人工授粉乃至受精的成功与否。目前，在杂交育种中常通过染色鉴定法和离体萌发法来测定花粉活力；果树栽培上，如苹果、李、核桃、猕猴桃等花粉在使用或贮藏前都可进行活力研究[3-7]，确保所用花粉具有足够活力。

香榧花粉既是其遗传育种、进化等的重要研究对象，也是孢粉分析、药物制造、生理实验的重要材料，对活性要求较大[3]。由于其本身特性如雌雄异株、花期不一致以及贵州省近几年才开始对香榧进行引种栽培，可用作授粉树的成年雄株较少，人工辅助授粉所用花粉多来源于外省香榧主产区，花粉在运输过程中存在很多不确定因素，故在授粉时花粉活性无法得到较好检测，仅靠经验判断有时会造成偏差，对香榧花粉活性监测就成为香榧栽培的重要步骤。本研究首先通过TTC染色法对香榧花粉活力进行检测，其次采用离体培养法测定，以筛选出较为合适的测试方法。对香榧产业规模化推广有很大意义[8]。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验所用香榧花粉来自贵州省植物园香榧基地。

1.2 方法和试验设计

2019年4月8日上午，一次性收集同株同批次香榧花粉至实验室，将试验所用镊子等工具用浓度为95%的分析纯酒精消毒后，待用。收集香榧花粉，放置在干燥、洁净容器内，用脱脂棉将容器密封，贴上标签，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.1TTC测定

1) 配制0.5%TTC溶液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5，放于深色瓶内备用；

2) 将待测花粉在SMART 15020188生物显微镜低倍镜(10×10倍)下观察。用棉签轻蘸少许，撒在具凹穴载玻片上，TTC不同pH溶液滴1～2滴，盖上盖玻片；

3) 将制片分别放置在25 ℃、30 ℃、35 ℃光照培养箱中30 min；

4) 取出制片，低倍显微镜下观察，染成红色的花粉说明其具有生活力且很强，淡红色次之，没有染色的为没有生活力或不育花粉。

5) 每个温度下观察3个制片，每个制片分别取2～3个视野，总计不少于100粒花粉，按照如下公式计算花粉活力：

花粉活力率(%)=[有活力的花粉数/(有活力的花粉数+无活力的花粉数)] ×100%。

1.2.2离体萌发测定

单因素设计为：

浓度 温度/℃283035蔗糖/(g·L-1)50 100150硼酸/(mg·L-1)10 50100

通过正交试验筛选满足香榧花粉离体培养最优配比条件。

1.2.3花粉萌发率的统计

在SMART 15020188生物显微镜低倍镜(10×10倍、10×100倍)下观察花粉。每个载玻片随机选取3个视野观察，每个视野花粉粒总数不少于50粒。参照花粉管长度≥花粉粒直径为标准，统计萌发花粉数量，计算均值[9]。

1.2.4最适培养基的筛选

通过单因素试验，得到花粉萌发的最适宜温度和所需的最适蔗糖和硼酸浓度。而后通过正交试验，确定上述因素的最佳组合，每个组合设置3次重复。

1.2.5数据统计

运用Excel软件录入数据及做图，SPSS 17.0软件对试验数据进行差异显著性分析[10-12]。

2 结果与分析

2.1 不同pH、不同温度对TTC测定的影响

由试验结果得，在TTC染色法下，香榧花粉活力有较好的表现效果(图1、图2)。花粉活力依次表现为30 ℃、pH 7.0>35 ℃、pH 7.0>30 ℃、pH 7.5>35 ℃、pH 7.5>30 ℃、pH 6.5>35 ℃、pH 6.5>35 ℃、pH 6.0>30 ℃、pH 6.0>25 ℃、pH 7.0>25 ℃、pH 6.5>25 ℃、pH 7.5>25 ℃、pH 6.0，其中30 ℃、pH 7.0下花粉活力表现最强，25 ℃下，pH 6.0时花粉活力表现最弱。如图3所示，pH 7.0时花粉活力在不同温度处理下均表现最强。相同温度下，pH 7.0花粉活力表现最活跃。pH偏低，使TTC溶液不易透过花粉外壁渗入细胞，不利于花粉粒着色；pH偏高，易在载玻片上出现少数红色斑点，即多余燃料沉积进而影响测试结果[13-17]。

注：A为染色成功的花粉；B为染色未成功的花粉。图1 TTC染色情况(一)

注：A为染色成功的花粉；B为染色未成功的花粉；C为活力较弱的花粉。图2 TTC染色情况(二)

图5 香榧花粉分别培养1 h、12 h、24 h后的情况

图3 不同温度、不同pH下香榧花粉活力情况

2.2 不同培养温度下香榧花粉萌发情况

由试验结果可得，同种香榧花粉、同种培养基，28 ℃处理下香榧花粉萌发率高于30 ℃和35 ℃，即花粉萌发颗粒数最多，花粉活力较高，差异极显著(p<0.01)，25 ℃下萌发率最低(图4)。

图4 不同培养温度下香榧花粉萌发情况

香榧系裸子植物而其与被子植物相比，最显著的特征之一是花粉萌发和花粉管生长速度极缓慢[3]，在培养基中萌发速度同样缓慢(图5)。每年4月中下旬完成(人工或自然)授粉，7月初花粉管萌发，直到8月底才开始受精作用[18,19]。通过离体萌发试验发现，花粉萌发较合适温度为28 ℃，结合贵州香榧产区温度调查和根据贵州气象站统计数据分析可得(图6)，每年7月为当地当年日均气温最高月，均值为29 ℃，8月日均最高气温为28 ℃。说明授粉当年，贵州香榧产区7、8月份的外部温度因子有利于香榧花粉管萌发、受精，有利于人工辅助授粉成功率的提高。

图6 贵州4—9月温度分布图

2.3 蔗糖浓度对香榧花粉萌发的影响

由图7可看出,单独用蔗糖溶液培养香榧花粉，结果显示花粉萌发率有明显变化。蔗糖浓度为100 g·L-1时, 花粉萌发较好(为46.89%)，150 g·L-1次之，50 g·L-1较弱，浓度为0时最差，无萌发。4个处理均差异显著(p<0.05)，0和100 g·L-1差异极显著(p<0.01)。香榧花粉萌发率随蔗糖浓度增加而提高，在蔗糖浓度达到花粉萌发最佳浓度时花粉的萌发率达到峰值，但蔗糖浓度再次增加，花粉萌发率反而下降，高浓度蔗糖溶液反而抑制了花粉萌发，这表明蔗糖浓度对香榧花粉萌发具有明显影响[4,20]。

2.4 4种浓度硼酸对香榧花粉萌发的影响

由图8可知，硼酸浓度为0时，花粉活力最低，无萌发。不同浓度硼酸对花粉的萌发有促进作用，随着浓度的增加，花粉活力也呈现递增的趋势。在100 mg·L-1硼酸作用下花粉萌发率达48.31%，极显著高于0和10 mg·L-1浓度梯度，与50 mg·L-1差异不显著；说明硼酸对香榧花粉萌发有促进作用。

图7 不同蔗糖浓度对香榧花粉萌发的影响

图8 不同硼酸浓度对香榧花粉萌发的影响

表1 香榧花粉萌发L9(33)试验结果

2.5 香榧花粉萌发最适培养基的选择

通过正交试验筛选满足香榧花粉离体培养最优配比环境条件，由表1可知，每个处理组合都可以促使花粉萌发，但是萌发率不同。其中处理5的环境下，萌发率最高，达49.97%，显著高于其他处理。与单因素条件下结论略有差异，证明在离体培养环境中每个因素相互作用达到最佳条件才能发挥最大效果，即使花粉萌发达到最佳状态。

3 小结与讨论

3.1 TTC染色

染色温度、pH溶液会对染色结果产生影响。在生产中，人工授粉检验花粉活性时，可以选择30 ℃、pH 7.0快速得出鉴定结果，方便对花粉生活力进行实时监测，提高花粉的利用率。同时应注意,染色培养过程需选择避光或弱光，培养箱光照效率60%以上时，0.5 h内花粉活力染色不显著。

3.2 离体萌发

蔗糖作为能源物质，为花粉萌发、花粉管生长提供营养和能量。合适的蔗糖浓度还可以调节培养基的渗透压[3]。培养基浓度低于花粉内部渗透压时，花粉管壁易破裂，花粉内容物析出，引起花粉失活。但蔗糖浓度对花粉活力的影响存在阈值效应，其存在一个峰值，随着蔗糖浓度升高，香榧花粉的萌发反而下降，抑制花粉萌发。可能由于离体培养基中蔗糖浓度过高，造成花粉质壁分离进而抑制花粉萌发。只有合适的蔗糖浓度才能维持花粉的正常生活力，促进花粉萌发[21]。本试验认为浓度50～150 g·L-1的蔗糖对香榧花粉萌发存在促进作用，但150 g·L-1时萌发始进入下降趋势，100 g·L-1蔗糖浓度对香榧花粉离体萌发较为合适。

有研究证明，硼是植物最易缺乏的微量元素之一，尤其是在生殖生长阶段，植物体对于硼有大量的需求。由于自然条件下，多数植物花粉粒中硼含量较低，但柱头、花柱、子房中硼浓度却较高，故授粉后，花粉粒才能进一步萌发、受精。缺硼会导致玉米等多种单子叶及双子叶植物花畸形，生殖器官发育异常、花而不实等，硼是花粉萌发的必须物质[22,23]。由本研究可见，在香榧花粉离体培养的培养基中, 以硼酸浓度为100 mg·L-1最适宜。

同时，通过花粉萌发L9(33)正交试验结果筛选出香榧花粉最优离体培养条件：28 ℃培养100 g·L-1蔗糖+50 mg·L-1硼酸的培养基。

综上，通过对香榧花粉进行活力试验，TTC染色和离体培养下花粉萌发所得结论基本一致，在香榧产业化栽培中，根据实际需要来选择合适方法检测花粉生活力。本研究对香榧花粉运输、贮藏中温湿度的控制等均具有一定的理论指导意义。此外，为了提高授粉率，在不添加植物生长调节剂的情况下，可在人工授粉时将花粉溶液与蔗糖按照一定比例喷洒授粉。由于生产、科研需要，花粉活力测定在被子植物上应用较多，裸子植物较少，尤其香榧这一优质干果，在近几年才开始对其花粉活力进行研究，并且香榧花粉活力在个体间、种群或地区间是否存在差异等尚不明确，需要进一步研究探索。