QuEChERS结合UPLC-MS/MS测定水产品中9 种除草剂残留及基质效应

李丽春，刘书贵，尹 怡，汪玉洁，郑光明,，马丽莎，单 奇，戴晓欣，赵 城，谢文平，魏琳婷

（1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部水产品质量安全风险评估实验室（广州），农业农村部休闲渔业重点实验室，广东 广州 510380；2.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225）

随着水产业的蓬勃发展，水产养殖中药物残留问题日益严重，已成为食品安全热点问题之一。养殖池塘清除杂草和农田中使用的除草剂通过地表径流和渗透进入江河湖泊，进而污染养殖水体，造成水产品中残留除草剂，给消费者带来安全隐患。近年来，我国稻渔综合种养模式得到大力推广，涉及全国20多个省，全国稻渔综合种养面积2 800万 亩，产量194.75万 t，已成为水产养殖发展的一大亮点。我国是农业大国，除草剂的生产和使用位居世界前列，但由于不合理使用，60%的农药残留于环境中，对农产品造成污染[1]，水产养殖受水环境的影响较大，更易造成残留危害[2]，大多数除草剂残效期较长，可在生物体内富集，且部分除草剂对人体和动物有干扰内分泌系统的功能，甚至具有致癌性[3]。随着人民对食品安全的越发重视，各国政府对水产品中除草剂等农药加大了监管力度，并制定了严格的限量要求，日本制定的《食品中残留农业化学品肯定列表制度》中多数农药的限量值为0.01 mg/kg。目前水产品中除草剂残留的测定方法大多集中在单一化合物的测定[4]，仅有三嗪类除草剂采用多残留测定[5]。多类型除草剂在水产品中的同时检测鲜见报道，因此开发灵敏可靠的除草剂多残留检测技术十分必要，可为水产品中多种除草剂的检测分析和风险评估提供科学依据。

据报道，农药多残留测定多采用气相色谱[6-7]、气相色谱-质谱联用[8-11]、气相色谱-串联质谱[8-9,12]、液相色谱[13]和液相色谱-串联质谱[14-19]等，前处理方法大多采用均质振荡和加速溶剂萃取[7]，凝胶渗透色谱和固相萃取[5,20-21]。QuEChERS是新开发的一种快速、简便、低成本且环境友好的前处理方法，主要用于粮油作物[22-23]、茶叶[14,24]、水果[25]和蔬菜[26]等农产品中农药多残留测定[27]，近年来动物性食品中也有所应用[3,28-30]，但水产品中应用较少，水产品中多种除草剂的QuEChERS方法鲜见报道。本研究选择0.1%甲酸-乙腈溶液为提取溶剂，中性氧化铝为分散吸附剂，超高效液相色谱-串联质谱（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定，建立水产品中扑草津、乙草胺、丁草胺、二氯喹啉酸、苄嘧磺隆、甲磺隆、莠去津、利谷隆和灭草松的多残留分析方法，该方法准确、快速、低成本且环境友好。同时对该方法下基质种类、基质质量和除草剂质量浓度对基质效应的影响进行分析研究，有望建立快速、高效和准确的适用于水产品中多类型除草剂残留检测的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

对虾（9.0～12.0 cm）、鲤鱼（700～1 000 g）、鲫鱼（400～600 g）、鳙鱼（1 000～2 000 g） 市购；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 美国Burdick & Jackson公司；甲酸、乙酸（均为色谱纯） 美国Fisher公司；中性氧化铝（A-N）、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、弗罗里硅土、C18、石墨化碳黑（graphitizing of carbon black，GCB）（均为分析纯）天津Agela公司；扑草津、乙草胺、丁草胺、二氯喹啉酸、苄嘧磺隆、甲磺隆、莠去津、利谷隆、灭草松标准品（纯度＞98.0%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；氯化钠、无水硫酸镁（均为分析纯） 广州化学试剂厂；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

UPLC-Xevo TQD MS/MS仪（配备有电喷雾离子源及MassLynx V4.1数据处理系统） 美国Waters公司；MS3旋涡混匀器 德国IKA公司；Direct-Q3超纯水机美国Millipore公司；TDL-5-A离心机 上海安亭公司；N-EVAP-12氮吹仪 美国Organomation公司；3k15高速离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

准确称取适量的上述9 种除草剂标准品，分别用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1.0 mg/mL的单标储备液。分别移取上述单标储备液0.1 mL，用甲醇定容于同一10 mL的容量瓶中，配制成10 μg/mL的混合标准中间溶液。采用系列稀释法分别配制质量浓度为0.50、1.00、2.00、5.00、10、20、50 ng/mL和100 ng/mL标准工作溶液。所有标准溶液均于-18 ℃避光保存。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸），B为甲醇；流速0.20 mL/min；柱温30 ℃；进样体积10 μL，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Program of gradient elution

1.3.3 质谱条件

表2 质谱参数Table 2Optimized ESI MRM-MS instrument parameters

电喷雾离子源正离子模式；离子传输毛细管温度350 ℃；离子源温度150 ℃；去溶剂气流速为650 L/h，锥孔流速50 L/h，扫描模式为多反应监测，其他参数见表2。

1.3.4 样品前处理

提取：准确称取5.00 g已绞碎混匀的肌肉组织样品于50 mL具塞离心管中，加入5 mL蒸馏水和10 mL 1%甲酸-乙腈溶液，同时加入1.5 g氯化钠和5.0 g无水MgSO4，高速涡旋混匀1 min，超声10 min，5 000 r/min离心5 min。

净化：上清液转移至含200 mg中性氧化铝的15 mL离心管中，高速涡旋30 s，5 000 r/min离心5 min。上清液转移至15 mL玻璃离心管中，40 ℃氮气吹干，用2 mL甲醇-5 mmol/L乙酸铵（1∶1，V/V）复溶，过0.22 μm微孔滤膜，待UPLC-MS/MS检测。

1.3.5 基质效应

水产品中含量较高的蛋白质和脂肪等杂质易引起基质增强或基质抑制效应，有关研究表明基质种类、基质质量和除草剂质量浓度对基质效应有一定影响[31]。因此建立水产品中除草剂残留分析方法应考虑基质效应对检测结果的影响，本研究采用提取后加标法，分析基质种类、除草剂质量浓度和基质质量对基质效应的影响，以空白基质提取液与纯溶剂中目标分析物峰面积的百分比评价基质效应[28,31-32]，按下式计算：

式中：Am为基质提取液中目标分析物峰面积；As为纯溶剂中目标分析物峰面积。

1.3.6 实际样品的测定

采集广东省稻鱼综合种养模式下的鲤鱼样品10 份，每份样品不少于10 尾，采用本研究建立的前处理方法和色谱条件测定其体内除草剂残留量。

1.4 数据统计及图表绘制

本研究所有数据均在Waters公司的MassLynx V4.1软件下采集，采用MassLynx V4.1SCN843处理方法对检测结果进行定性和定量分析。采用Excel 2016进行数据统计和表格制作，并采用GraphPad prism8.0进行图像处理。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

甲醇、乙腈和乙酸铵是液相色谱法测定除草剂等农药残留的常用流动相[33-34]，电喷雾离子源正离子模式下在流动相中加入一定量的甲酸，可以增加目标物的离子化状态，提高其离子化效率，达到改善峰形，提高分离度的效果。通过优化色谱分离条件，可使目标物与抑制电离的基质实现最大程度的分离，降低基质效应。本研究比较甲醇-5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）溶液作流动相时目标物的响应，结果表明大部分目标物在甲醇-5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）溶液的流动相中有较高的响应且峰形尖锐对称。因此本研究采用甲醇-5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）溶液为流动相。图1为UPLC-MS/MS分析9 种除草剂的色谱图。

图1 9 种除草剂标准品的多反应监测色谱图（10 ng/mL）Fig.1 MRM chromatograms of 9 herbicide standards (10 ng/mL)

2.2 提取溶剂的选择

图2 不同提取溶剂对9 种除草剂加标回收率Fig.2 Recoveries of 9 herbicides with different extraction solvents

除草剂等农药的QuEChERS方法中大多采用甲醇、乙腈和酸化乙腈作为提取溶剂[35-36]。本研究在鳙鱼肌肉中加入5.0 μg/kg的除草剂混合标准溶液，比较甲醇、乙腈、1%甲酸-乙腈溶液和1%乙酸-乙腈（V/V）溶液对9 种除草剂的提取效率。如图2所示，甲醇的提取效率较差，9 种除草剂加标回收率在50%以下，其原因可能是甲醇盐析效果不佳所致。乙腈在有效提取目标物的同时可沉淀蛋白，减少弱极性成分的提取，且盐的加入可有效促进乙腈与水的分层，提高提取率。甲酸的酸性较强，1%甲酸-乙腈溶液pH值较低有利于酸性农药（二氯喹啉酸）的提取，9 种除草剂平均回收率在80%～120%之间。因此采用1%甲酸-乙腈溶液作为QuEChERS的提取溶剂。

2.3 超声时间对回收率的影响

图3 超声时间对回收率的影响Fig.3 Effect of ultrasonication time on recoveries

采用基质加标的方法对超声时间进行优化选择。以5.0 μg/kg为加标量，分别超声提取0、5、10、15 min和20 min，分析超声时间对回收率的影响。如图3所示，随超声时间的延长，加标回收率有所增加，尤其是二氯喹啉酸和甲磺隆，超声提取可大大改善其回收率。超声10 min时9 种除草剂回收率在94.49%～111.86%之间，而超声15 min后莠去津、灭草松、甲磺隆和丁草胺回收率有所降低，因此本方法采用超声提取10 min进行样品前处理。

2.4 净化过程的优化

图4 净化剂种类对加标回收率的影响（5.0 μg/kg）Fig.4 Influence of cleaning agent type on recoveries (5.0 μg/kg)

QuEChERS方法常用的净化剂有PSA、C18、GCB、中性氧化铝和弗罗里硅土，PSA通常用于去除提取液中的脂类和糖类物质，C18具有良好的除脂能力，GCB可去除提取液中的色素成分，但对含苯环官能团的化合物有较强的吸附作用。本研究优化比较PSA、C18、GCB、中性氧化铝和弗罗里硅土5 种吸附剂对9 种除草剂的净化效果。如图4所示，在同一基质（鳙鱼）中加入5.0 μg/kg的9 种除草剂混合标准溶液，分别用200 mg的上述5 种吸附剂净化，比较其回收率。结果表明，GCB对9 种除草剂均有一定吸附性，对二氯喹啉酸、苄嘧磺隆、丁草胺、利谷隆和莠去津吸附较强，其回收率在60%以下；C18对丁草胺吸附较强，回收率仅为24.70%；弗罗里硅土对扑草津和灭草松有较强吸附性，其加标回收率低于30%；PSA对二氯喹啉酸吸附较强其回收率仅为50%。而采用中性氧化铝对样品进行净化可获得较好的回收率，9 种除草剂加标回收率在92.27%～103.42%之间。

图5 中性氧化铝用量对回收率的影响（5.0 μg/kg）Fig.5 Influence of amount of neutral alumina used on recoveries (5.0 μg/kg)

同时本研究对中性氧化铝的用量进行优化选择，采用空白鳙鱼样品添加5.0 μg/kg除草剂标准溶液，比较100、200、400、600、800 mg和1 000 mg中性氧化铝的净化效果。如图5所示，中性氧化铝用量对加标回收率有较大影响，100 mg中性氧化铝净化时，莠去津、甲磺隆和二氯喹啉酸回收率较低，在61.94%～81.65%之间，乙草胺、丁草胺和灭草松回收率均高于120%，可能原因是净化不干净基质效应较强。随中性氧化铝用量的增加，回收率呈降低趋势，中性氧化铝用量为200 mg时9 种除草剂加标回收率在98.03%～104.90%之间，回收率较好，本方法选择中性氧化铝用量为200 mg。

2.5 方法线性范围、检出限和定量限结果

采用系列稀释法用甲醇-5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）（1∶1，V/V）的定溶液配制质量浓度分别为0.50、1.00、2.00、5.00、10、20、50 ng/mL和100 ng/mL的混合标准溶液，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制校准曲线并做线性回归分析。如表3所示，9 种除草剂在0.50～100 ng/mL（二氯喹啉酸和利谷隆1.00～100 ng/mL）范围内线性良好，相关系数r大于0.99。在空白样品中添加9 种除草剂，以信噪比为3和10分别计算检出限和定量限，其检出限为0.20～0.50 μg/kg，定量限为0.50～1.50 μg/kg。

表3 9 种除草剂线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs for 9 herbicides

2.6 回收率和精密度结果

表4 9 种除草剂在4 种水产品基质中的加标回收率和精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precision of 9 herbicides spiked into 4 aquatic products (n= 6)

采用基质加标法，在对虾、鲤鱼、鲫鱼和鳙鱼样品中分别添加3 个质量浓度水平（定量限、3 倍定量限和5 倍定量限）的9 种除草剂，对其加标回收率和精密度进行考察，每个添加水平重复6 次。如表4所示，9 种除草剂在4 种水产品基质中的加标回收率和精密度分别为84.33%～116.37%和0.80%～13.81%，回收率和精密度均满足国内外对水产品中除草剂残留检测的要求。

2.7 基质效应

采用建立的前处理方法和仪器条件，分别测定空白基质提取液和纯溶剂中目标物的响应强度，通过二者峰面积的百分比评价基质效应。基质效应越接近100%，基质效应越小，大于100%，表面存在基质增强效应，相反基质效应小于100%，则存在基质抑制效应[32]。

2.7.1 除草剂质量浓度对基质效应的影响

采用提取后加标法，分析除草剂质量浓度（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL和100 ng/mL）在对虾、鲤鱼、鳙鱼和鲫鱼基质中的基质效应。如图6所示，除草剂质量浓度对基质效应有一定影响，4 种基质中二氯喹啉酸、甲磺隆和苄嘧磺隆均存在基质增强效应，在鲤鱼和对虾中当除草剂质量浓度低于10 ng/mL时，基质增强效应较为明显（＞150%）。在鲫鱼和鳙鱼中乙草胺、利谷隆、灭草松和莠去津基质抑制效应较为明显，但受除草剂浓度影响较小。由此可知目标分析物浓度可影响基质效应，在测定水产品中除草剂残留时，应考虑基质效应的影响。

图6 除草剂质量浓度对基质效应的影响（n=6）Fig.6 Effect of herbicide concentration on matrix effect (n = 6)

2.7.2 不同基质的基质效应

比较同一质量浓度（20 ng/mL）条件下9 种除草剂在对虾、鲫鱼、鲤鱼和鳙鱼中的基质效应。如图7所示，基质种类对其基质效应有一定影响，4 种水产品基质中扑草津基质效应在80%～120%之间，灭草松在4 种水产品种存在较强的基质抑制效应（＜60%）。二氯喹啉酸、甲磺隆和苄嘧磺隆在4 种水产品基质中基质效应存在较大差异，在鲤鱼和对虾中均存在较高的基质增强效应（120.90±12.29）%～（170.72±12.38）%；丁草胺、乙草胺、利谷隆、灭草松和莠去津在4 种水产品中均表现为基质抑制效应，因此在测定水产品中除草剂残留量时应考虑基质效应的影响。

图7 不同基质的基质效应Fig.7 Matrix effects for different types of matrices

2.7.3 不同基质质量的基质效应

图8 不同基质质量的基质效应Fig.8 Matrix effects with different matrix masses

采用提取后加标法比较不同基质质量的基质效应，按照上述前处理方法，分别以2.0、5.0 g和10 g样品，提取净化后用9 种除草剂混标配制成质量浓度为50 ng/mL基质标样，采用建立的色谱条件进行测定，分析不同基质质量的基质效应。如图8所示，在对虾、鲤鱼和鳙鱼中，基质质量对基质效应影响较小；2.0 g鲫鱼基质中甲磺隆存在较强的基质增强效应，5.0 g和10 g鲫鱼基质中9 种除草剂均表现为基质抑制效应。因此为了保证9 种除草剂在水产品中的检出限和定量限，选择5.0 g样品进行残留测定较为合理。

2.8 实际样品测定结果

采用建立的方法对广东省稻鱼养殖产地水产品中除草剂残留进行检测，共采集鲤鱼样品10 份，其中1 份检出甲磺隆，含量为2.26 μg/kg；2 份样品检出苄嘧磺隆，含量分别为0.71 μg/kg和20.30 μg/kg；6 份样品检出丁草胺，含量为7.22 ～24.85 μg/kg；9 份样品检出乙草胺，含量为9.39～18.91 μg/kg。

3 结 论

本研究建立水产品中9 种除草剂残留的QuEChERS结合UPLC-MS/MS检测方法，样品经1%甲酸酸化乙腈提取，中性氧化铝净化，甲醇-5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）定容后UPLC-MS/MS测定，采用基质标准曲线外标法定量。9 种除草剂在0.50～100 ng/mL之间（二氯喹啉酸和利谷隆1.00～100 ng/mL）范围内线性良好，相关系数r大于0.99。9 种除草剂检出限为0.20～0.50 μg/kg，最低定量限为0.50～1.50 μg/kg。4 种水产品基质中其加标回收率和精密度分别为84.33%～116.37%（n=6）和0.80%～13.81%（n=6）。该方法检出限和定量限较低，加标回收率和精密度较好，且前处理简单、灵敏度、重复性和准确性较好，适用于水产品中除草剂残留的定性、定量分析。

采用UPLC-MS/MS联用法测定水产品中除草剂残留时，对虾、鲫鱼、鲤鱼和鳙鱼对9 种除草剂均存在基质效应，且基质种类、基质质量和除草剂质量浓度对基质效应有一定影响。4 种水产品基质中扑草津基质效应在80%～120%，二氯喹啉酸、甲磺隆和苄嘧磺隆在鲤鱼和对虾中均存在较高的基质增强效应；丁草胺、乙草胺、利谷隆、灭草松和莠去津在4 种水产品基质中均表现为基质抑制效应。在实际检测中，应考虑基质效应对检测结果的影响，建议在检测水产品中除草剂残留时采用基质校准曲线降低基质效应确保检测结果的准确性。