葛氏鲈塘鳢鱼头多糖的制备、结构鉴定及体外生物活性分析

高阳杨，闫晓慧，朱 畅，张佳霖，刘学军,

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118；2.吉林工商学院财税学院，吉林 长春 130507；3.吉林工程职业学院食品工程分院，吉林 四平 136000；4.吉林省轻工业设计研究院，吉林 长春 130021）

葛氏鲈塘鳢（Perccottus glenii），塘鳢科，鲈塘鳢属，俗名老头鱼、沙姑鲈子，是我国北方地区一种小型底栖肉食性土著鱼类，主要分布于黑龙江、图门以及辽河水系。与一般淡水鱼相比，葛氏鲈塘鳢生命力强、极耐缺氧、肉质细嫩、无肌间刺，是最受消费者青睐的淡水鱼类品种之一[1]。但其头部大，肉质少，经常被丢弃。

糖类的研究重点已经从单纯的结构研究转向构效关系。研究表明多糖具有抗氧化[2]、抗疲劳[3]、抑制肿瘤[4]、抑菌[5]、提高人体免疫力[6]、降血压[7]、降血糖[8]等生物活性。在动物多糖方面，仅集中于部分水产品，如鲍鱼内脏[9]、牡蛎肉[10]、池沼公鱼多糖[11-12]等方面的研究，而对于葛氏鲈塘鳢鱼头多糖（polysaccharide fromPerccottus gleniihead，PGP）的研究鲜见报道。

目前，已有研究表明淡水鱼鱼头中含有较高含量的多糖[13]。因此，本实验研究PGP的制备工艺、结构表征及生物活性，为副产物资源的综合利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的葛氏鲈塘鳢购于长春市同鑫水产批发市场，取鱼头洗净分装于真空包装袋中，-20 ℃保存。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、阿卡波糖、血管紧张素I转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯-α-D-半乳糖吡喃葡萄糖苷（p-nitrobenzene-α-D-galactose glucopyranoside，PNPG）、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（horseuria-histamine-leucine，HHL） 美国Sigma公司；胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 上海源叶生物有限公司；有机溶剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

H-2050R离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；FD-80型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；IR RESTIGE-21傅里叶变换红外光谱仪 日本岛津公司；XL-30 ESEM FEG扫描电子显微镜 美国FEI公司；6890-5975型气相色谱-质谱联用仪美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖提取

取葛氏鲈塘鳢鱼头（100 g）洗净沥干，破碎机破碎；按料液比1∶3（g/mL）加入石油醚浸泡（30 ℃、 2 h）；按料液比1∶2（g/mL）加入生理盐水匀浆10 min；4 ℃离心（3 800×g、15 min）后，获得沉淀物和上清液1；沉淀物中加入5 倍体积0.1 mol/L的NaOH溶液进行碱解（30 ℃、8 h），随后4 ℃离心（3 800×g、15 min），获得上清液2；合并上清液1和上清液2，旋转蒸发，抽滤去杂，获得浓缩液；浓缩液中加入4 倍体积的95%乙醇溶液（4 ℃、12 h）；醇沉后离心（3 800×g、15 min），将沉淀冷冻干燥，获得PGP。

1.3.2 多糖得率与含量测定

1.3.2.1 多糖得率的测定

按式（1）计算多糖得率[14]：

1.3.2.2 总糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法[15]。在波长490 nm处测定吸光度，以葡萄糖为对照品绘制标准曲线，回归方程为Y=0.011 08X＋0.000 4，R2=0.999 6。式中：X为质量浓度（mg/mL），Y为吸光度。根据回归方程计算样品总糖的质量浓度，按式（2）计算总糖质量分数：

1.3.2.3 蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法[16]。在波长595 nm处测定吸光度，以BSA为标准品绘制标准曲线，回归方程为Y=0.006 6X＋0.009 6，R2=0.999。式中：X为质量浓度（mg/mL）；Y为吸光度。根据回归方程计算样品蛋白质的质量浓度，按式（3）计算蛋白质量分数：

1.3.2.4 脂肪含量及脱除率的测定

分别制备葛氏鲈塘鳢鱼头未脱脂和经石油醚脱脂的粗多糖，对2 种多糖采用索氏抽提法[16]按式（4）、（5）计算脂肪质量分数和脱除率：

1.3.3 PGP脱蛋白工艺筛选

采用Sevag法、胃蛋白酶法、胃蛋白酶法与Sevag法联用、木瓜蛋白酶法以及木瓜蛋白酶法与Sevag法联用脱除蛋白质。按式（6）～（8）计算蛋白脱除率、多糖损失率及羟自由基半清除率，以衡量脱蛋白效果。

式中：A0为蒸馏水代替样品的吸光度；Ax为样品组的吸光度；Ax0为蒸馏水代替H2O2的吸光度。

1.3.3.1 Sevag法

参照伍善广等[17]的方法，采用Sevag试剂（氯仿-正丁醇（4∶1，V/V））对PGP样品进行脱蛋白处理，重复操作6 次，每次均取出一定量的上层水溶液测定并按式（6）～（8）计算蛋白脱除率、多糖损失率及羟自由基半清除率。

1.3.3.2 胃蛋白酶法

参照李冬梅[18]的方法，加入2%胃蛋白酶对PGP样品进行酶解脱蛋白处理，离心取上清液测定并按式（6）～（8）计算蛋白脱除率、多糖损失率及羟自由基半清除率。

1.3.3.3 胃蛋白酶与Sevag法联用

根据1.3.3.2节获得胃蛋白酶脱蛋白多糖溶液，再根据1.3.3.1节Sevag法进行一次脱蛋白处理，测定并按式（6）～（8）计算蛋白脱除率、多糖损失率及羟自由基半清除率。

1.3.3.4 木瓜蛋白酶法

参照于晓红等[19]的方法，加入2%木瓜蛋白酶对PGP样品进行酶解处理。离心取上清液测定并按式（6）～（8）计算蛋白脱除率、多糖损失率及羟自由基半清除率。

1.3.3.5 木瓜蛋白酶与Sevag法联用

根据1.3.3.4节获得木瓜蛋白酶脱蛋白多糖溶液，再根据1.3.3.1节的Sevag法进行一次脱蛋白处理。测定并按式（6）～（8）计算蛋白脱除率、多糖损失率及羟自由基半清除率。

将5 种脱蛋白方法建组对比，分析最优脱蛋白工艺。将PGP脱蛋白溶液进行醇沉、离心、透析、冷冻干燥，获得脱蛋白多糖（deproteinized polysaccharides fromPerccottus gleniihead，PGP-D）。

1.3.4 单糖组成测定

1.3.4.1 多糖的水解

精确称取10 mg PGP-D于反应釜中，加入2 mL的4 mol/L三氟乙酸溶液，置于烘箱内110 ℃水解3 h，冷却至室温，放入真空干燥箱70 ℃减压干燥。

1.3.4.2 多糖的衍生

向经水解干燥的PGP-D中加入1 mL吡啶后，立即加入1 mL硅烷化试剂，防止空气中的水分进入。振荡充分溶解后，于50 ℃恒温干燥箱中反应40 min，冷却至室温，取上清液进行气相色谱-质谱联用测定其单糖组成。

1.3.4.3 气相色谱-质谱检测条件

气相色谱条件：DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度280 ℃；接口温度280 ℃；载气为氦气；柱压73.0 kPa；柱流量1 mL/min；分流比10∶1；程序升温：80 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，进样量1 μL。

质谱条件：离子源温度200 ℃，质量扫描范围m/z20～800。

1.3.5 紫外光谱测定

用蒸馏水配制质量浓度为0.050 mg/mL的PGP-D溶液，注入石英比色皿中，使用紫外-可见分光光度计，以蒸馏水校准基线，在190～400 nm内进行全波长扫描[20]。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱测定

将PGP-D与KBr按质量比1∶100充分研磨混匀后压片。以KBr为空白，置于傅里叶变换红外光谱仪，在4 000～400 cm-1区间内进行红外光谱扫描[21]。

1.3.7 扫描电镜观察

样品进行镀金后，采用扫描电子显微镜观察PGP和PGP-D表面的微观形态[22]。

1.3.8 体外生物活性测定

1.3.8.1 羟自由基清除能力测定

参照Fan Jing等[23]的方法，以VC为阳性对照，采用Fenton反应体系测定不同质量浓度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）多糖样品溶液对羟自由基的清除能力，按式（8）计算。

1.3.8.2 总还原能力测定

参照Hu Haobin等[24]的方法，以VC为阳性对照，测定不同质量浓度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的多糖样品溶液的总还原能力。在波长700 nm处测定溶液的吸光度，吸光度越大代表还原能力越强。

1.3.8.3α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

参照Zhang Ziling[25]、徐静珠[26]等的方法，采用PNPG比色法测定不同质量浓度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）的多糖样品溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制能力。在波长400 nm处测定酶作用下释放出硝基酚含量的吸光度。样品对α-葡萄糖苷酶抑制率按式（9）计算。

式中：Aa为对照组的吸光度；Ab为对照空白组的吸光度；Ac为样品组的吸光度；Ad为样品空白组的吸光度。

1.3.8.4 ACE抑制活性测定

参照Tan[27]、张梦娟[28]等的方法，测定不同质量浓度（0、2、4、6、8、10 mg/mL）多糖样品溶液对ACE的抑制能力。在波长228 nm处测定吸光度，ACE抑制率按式（10）计算：

式中：Aa为ACE和ACE抑制剂同时存在的吸光度；Ab为不加抑制剂的吸光度；Ac为ACE和HHL空白反应的吸光度。

1.4 数据分析与处理

2 结果与分析

2.1 PGP理化性质

PGP得率为8.2%，总糖质量分数为11.5%，蛋白质量分数为69.9%，未脱脂脂肪质量分数为0.6%，脱脂脂肪质量分数为0.1%，脱脂率为83.3%。

2.2 PGP脱蛋白工艺筛选

图1 Sevag法（a）、酶法及酶联合Sevag法（b）的蛋白脱除率Fig.1 Protein removal rates of Sevag method (a) and single enzymes and enzyme combined with Sevag deproteinization (b)

如图1a所示，随脱蛋白次数的增加，蛋白脱除率和多糖损失率均呈现上升趋势，羟自由基的半清除率呈现下降趋势。用Sevag法处理6 次后，蛋白脱除率为71.1%，多糖损失率为55.9%，羟自由基的半清除率为29.5%。表明在脱蛋白过程中，会损失部分多糖。

如图1b所示，采用胃蛋白酶-Sevag法联用脱蛋白，蛋白脱除率最高，达87.2%，但多糖损失率为15.9%，羟自由基半清除率为44.7%。酶法脱蛋白时，胃蛋白酶比木瓜蛋白酶脱蛋白效果好，采用胃蛋白酶脱蛋白的蛋白脱除率为86.0%，多糖损失率为3.7%，羟自由基半清除率为47.6%。虽然胃蛋白酶-Sevag法联用的蛋白脱除率有小幅度的提高，但多糖损失率增大，并且Sevag试剂会对多糖的结构造成破坏，使多糖失去活性。胃蛋白酶法反应条件温和，可将蛋白酶解成相对分子质量较小的多肽或氨基酸，醇沉后多肽及氨基酸保留在溶液中，大分子多糖得到沉淀，降低多糖的损失率。但由于少部分蛋白与多糖紧密结合形成糖肽或糖蛋白，导致任何一种脱蛋白工艺都不能将蛋白完全除去[29]。因此，为了更好地测定多糖的活性和结构，选择胃蛋白酶脱除蛋白。此外，本实验结果与葛炳艳[30]和陈桂冰[31]等的研究结果基本一致。

2.3 扫描电镜分析

图2 PGP和PGP-D的扫描电镜形貌图Fig.2 SEM images of PGP and PGP-D

如图2所示，PGP（图2a、b）和PGP-D（图2c、d）的表面微观形貌有较大差异。PGP具有颗粒感、整体呈球状、表面粗糙凹凸不平、沟壑明显，可能是由于PGP成分复杂，与蛋白结合紧密，相互包裹导致。经脱蛋白处理后，PGP-D呈现片状、棱角分明、厚度均一、表面光滑紧密，说明成分相对均一，分子间相互作用力较强，放大至5 000 倍可见表面有轻微凹凸点。高倍下看到的仅是多糖的表面形貌，进一步的形态连接特征需借助更精密的仪器和设备。

2.4 单糖组成分析

如图3a所示，混合标准品中各单糖的出峰顺序依次为阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，其出峰时间依次为13.794、13.935、14.201、14.370、14.858、15.963、16.096、16.510、16.848、17.701 min和18.119 min。根据单糖标准品衍生化的保留时间鉴定PGP-D的单糖组成，如图3b所示，PGP-D的单糖组成主要为阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，相对含量依次为8.0%、3.3%、7.3%、3.6%、4.5%和45.6%，表明PGP-D为酸性杂多糖。

图3 单糖标准品（a）和PGP-D（b）的气相色谱-质谱图Fig.3 GC-MS profiles of mixed monosaccharide standard (a) and PGP-D (b)

2.5 紫外光谱分析

图4 PGP-D的紫外-可见吸收光谱图Fig.4 UV-visible absorption spectrum of PGP-D

如图4所示，在波长190～400 nm内，PGP-D在波长200 nm处具有特征吸收峰，表明该样品属于多糖类物质；在波长260 nm处无吸收峰，表明不含核酸；在波长280 nm处有微弱吸收峰，表明经脱蛋白处理后，仍有少量蛋白与多糖紧密结合[32-33]，与脱蛋白工艺处理结果一致。

2.6 傅里叶变换红外光谱分析

如图5所示，样品在3 300.20 cm-1处为O—H的伸缩振动峰[34]；在2 960.73、2 931.80、2 873.94 cm-1处为CH3、CH2的CH伸缩振动峰[34]；在1 392.61、1 309.67 cm-1为—COOH的C—O伸缩振动，证明存在糖醛酸结构[35]；1 109.07 cm-1处为C—O键伸缩振动峰[36]；在1 109.07～1 026.13 cm-1之间存在3 个拉伸峰，证明存在C—O键和吡喃糖环[37]；在904.61 cm-1处为β-糖苷键的特征吸收峰，表明该物质符合糖类结构[35]，是一种含有β-糖苷键的吡喃酸性杂多糖；在665.44 cm-1处为鼠李糖的特征吸收峰[35]。上述结果与气相色谱-质谱、紫外光谱结果一致。

图5 PGP-D的傅里叶变换红外光谱图Fig.5 FTIR spectrum of PGP-D

2.7 体外抗氧化活性分析

2.7.1 羟自由基清除能力分析

图6 PGP和PGP-D羟自由基清除能力Fig.6 Scavenging capacities of PGP and PGP-D on hydroxyl radicals

由于羟自由基很容易穿过细胞膜导致组织损伤或细胞死亡，因此，除去羟自由基对保护生命系统非常重要[38]。如图6所示，多糖质量浓度与羟自由基清除率呈正相关，PGP对羟自由基的IC50值为2.8 mg/mL，PGP-D对羟自由基的IC50值为2.1 mg/mL，经脱蛋白处理后，多糖纯度得到提高，使PGP-D清除羟自由基的能力优于PGP。与罗敬文等[39]从玉木耳中提取的多糖对羟自由基的IC50值为2.4 mg/mL，王姣等[9]从鲍内脏中获得的多糖对羟自由基的IC50值为7.1 mg/mL，孙玉林等[40]发现拟目乌贼肌肉多糖对羟自由基的IC50值为12.4 mg/mL，相比活性较强。

2.7.2 总还原能力分析

图7 PGP和PGP-D总还原能力Fig.7 Total reducing power of PGP and PGP-D

如图7所示，随质量浓度增加，PGP和PGP-D的还原能力均呈现上升趋势。在质量浓度为10 mg/mL时，PGP的吸光度为2.100，PGP-D的吸光度为2.811，其中PGP-D是VC总还原能力的57.1%。经胃蛋白酶脱蛋白后，PGP-D表现出更强的还原能力。与宋荪阳等[41]从扇贝性腺中提取的多糖，在质量浓度为10 mg/mL时吸光度为0.255，许女等[42]从鸡腿菇子实体中提取的多糖，在质量浓度为8 mg/mL时吸光度为0.730，相比活性较强。

上述结果表明PGP-D可以作为抗氧化剂。研究认为，多糖的生物活性受其结构特征的影响，如原料、提取过程、单糖组成及糖苷键类型等方面的差异将导致抗氧化活性的不同[43-45]。首先，糖醛酸被认为是反映多糖抗氧化活性的重要指标。据报道，许多含有一定量糖醛酸的酸性多糖可作为优良的抗氧化剂[46-47]，这可能是因为在酸性多糖中存在亲电基团，例如酮或醛，有助于从O—H键中释放出氢[48]，由单糖组成分析可知，PGP-D中含有50.1%的糖醛酸（葡萄糖醛酸45.6%、半乳糖醛酸4.5%）。其次，揭示了单糖的组成和比例与抗氧化活性大小明显相关。Meng Lei等[49]认为抗氧化活性与甘露糖和葡萄糖的含量相关，在PGP-D中，甘露糖相对含量为7.3%。有关葛氏鲈塘鳢多糖抗氧化活性机理鲜见报道，有待于进一步探讨。

2.8 α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

图8 PGP和PGP-D对α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.8 Inhibition rates of α-glucosidase by PGP and PGP-D

餐后高血糖是II型糖尿病最早发生的代谢异常现象[50]。α-葡萄糖苷酶是寡糖降解为葡萄糖的关键酶，该酶是治疗餐后高血糖的靶点。如图8所示，多糖质量浓度与α-葡萄糖苷酶抑制效果呈正相关。当质量浓度为10 mg/mL时，阳性对照组阿卡波糖的抑制率为59.8%，PGP的抑制率为32.1%，是阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶能力的53.7%。而PGP-D对α-葡萄糖苷酶活性具有较弱的促进作用，这与黄霞[51]采用碱提法从杭白菊中提取的CMP-A多糖对α-葡萄糖苷酶的效果相似。

据Xu Ping等[50]报道，当蛋白质结合酸性杂多糖时，会对α-葡萄糖苷酶产生抑制作用，随蛋白质含量的增加，抑制能力会得到改善，但其潜在的机制尚不清楚。

2.9 ACE活性抑制分析

图9 PGP和PGP-D对ACE的抑制率Fig.9 Inhibition rates of ACE by PGP and PGP-D

ACE通过转换肾素-血管紧张素系统中的血管紧张素I催化产生血管紧张素II，而血管紧张素II是一种导致高血压的血管收缩因子。如图9所示，多糖质量浓度与ACE抑制效果呈正相关性。在质量浓度为10 mg/mL时，PGP的抑制率为71.7%，PGP-D的抑制率为98.2%。与张梦娟[28]从天麻中获得多糖的87.2%，Tan等[27]从苦瓜中提取多糖的94.1%相比，PGP-D表现出更强的ACE抑制能力。

3 结 论

本实验优化的PGP脱蛋白方法为胃蛋白酶水解法，脱除率为86.0%，多糖损失率为3.7%，羟自由基半清除率为47.6%。PGP-D是一种含有β-糖苷键的酸性杂多糖，组成的单糖为阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸，相对含量分别为8.0%、3.3%、7.3%、3.6%、4.5%和45.6%。PGP-D的总还原能力、对羟自由基清除能力及ACE的抑制能力优于PGP，且均呈量效正相关，PGP对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性。