“双固一通”灸法对糖尿病及糖尿病周围神经病变大鼠胰岛素抵抗的影响*

曾 林，向 婷，王天沛，胡 霞，唐宏图，3△

(1.湖北中医药大学，湖北 武汉 430065； 2.解放军广州军区武汉总医院，湖北 武汉 430070；3.针灸治未病湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430061)

糖尿病(DM)是胰岛素分泌的缺陷或(和)胰岛素作用障碍所导致的一组以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病以高血糖为主要标志，诱发各种严重的并发症，是糖尿病致死、致残的主要原因[1]。长期以来，胰岛素抵抗被认为是2型糖尿病发病的主要机制，而胰岛素抵抗最主要的分子生物学原因是胰岛素信号传导减弱或受阻。胰岛素信号转导途径必须是胰岛素首先与靶细胞膜上的受体结合才能发挥其生物效应[2]，所以胰岛素受体是关键环节，因而对胰岛素受体的研究在科研和临床上都有重要作用。本实验通过对DM、糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠血脂、炎症因子以及肝脏组织的胰岛素受体(InsR)基因表达的观察，拟探讨中医艾灸对防治糖尿病及糖尿病周围神经病变的作用机理。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择SPF级雄性SD大鼠75只，体质量为(200±20)g(3月龄)，实验动物由湖北中医药大学实验动物中心[实验动物许可证号：syxk(鄂)2017-0067]提供。适应性喂养1周，实验过程完全符合《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2 主要试剂及仪器

链尿佐菌素(Sigma)；InsR(PCR试剂盒，谷歌生物科技有限公司)；TNF-α(Elisa试剂盒，美国ADL生物科技公司)；IL-6 (Elisa试剂盒，美国ADL生物科技公司)；SLAN全自动荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技公司)；酶标仪(北京市格雷斯普科技开发公司)；DYY-Ш型电泳槽(北京市六一仪器厂)；HDJ-2核酸蛋白分析仪(江苏兴化分析仪器厂)；DKB-501A型恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；XKA-2200离心机(湖南长沙市湘仪集团公司)；自动生化分析仪(上海维世康医用电子有限公司)；动物实验用艾条(河南南阳汉方艾叶有限公司)。

1.3 造模方法

随机选取15只大鼠作为正常对照组(A组)，另60只大鼠禁食不禁水12 h后，左下腹腔注射链脲佐菌素(剂量为50 mg/kg)[3]。注射72 h后开始测血糖，凡血糖水平在16.7 mmol/L以上者列为糖尿病模型大鼠[4]。

1.4 实验分组和干预方法

从造模成功的糖尿病模型大鼠中随机抓取15只作为糖尿病模型组(B组)，再随机抓取15只作为15 minDM艾灸治疗组(C组)；剩余大鼠继续正常喂养4周成糖尿病周围神经病变大鼠模型，再随机分为DPN模型组(D组)15只、15 minDPN艾灸治疗组(E组)15只。

1.4.1 A组 不造模，不治疗。

1.4.2 B组 造模成功后不行艾灸治疗，正常喂养。

1.4.3 C组 造模成功后，取大鼠关元、双侧足三里、胰俞穴[5]，用实验动物用艾条(规格15.0 cm×0.5 cm)对各穴位先后进行悬灸，艾条距离穴位约5 cm，每穴15 min，每天1次，连续治疗4周后取材检测。

1.4.4 D组 不行艾灸治疗，正常喂养。

1.4.5 E组 治疗方法同C组。

1.5 指标检测

1.5.1 血脂检测 于4周治疗结束后和8周治疗结束后空腹眼底静脉采血，取血2 mL于促凝管中，室温静置30 min，3 500 r/min离心15 min，取血清用自动生化分析仪检测TC、TG、HDL-C、LDL-C。

1.5.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6含量的Elisa检测 第4周治疗结束后和第8周治疗结束后，用10%水合氯醛麻醉，麻醉状态下摘眼球取血2 mL于干燥试管中，室温放置约30 min，3 500 r/min离心15 min，取血清用Elisa方法检测TNF-α、IL-6的含量。

1.5.3 肝脏胰岛素受体InsR的PCR检测 在第4周、8周治疗结束后，用10%水合氯醛麻醉，后将大鼠断头处死，迅速取出肝脏，切成2 mm厚小条状，然后放入液氮中，-80℃冰箱中保存备用。

Trizol Rengent提取肝脏组织内总RNA，测定RNA浓度，逆转录生成cDNA，PCR反应扩增目的基因，反应条件为：50℃，2 min；95℃，2 min；95℃，15 s，退火15 s，72℃，45 s 3组一循环，共循环40次；72℃，10 min。引物序列见表1。采用Ct值比较法分析。

表1 引物序列表

1.6 统计方法

2 结果

2.1 “双固一通”艾灸法对各组大鼠血脂的影响

C组与B组比较，TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)；E组与D组比较，TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高(P<0.05)。详见表2～3。

表2 各组大鼠4周后血脂的变化

表3 各组大鼠8周后血脂的变化

2.2 “双固一通”艾灸法对各组大鼠TNF-α、IL-6的影响

B组和D组血清肿瘤坏死因子TNF-α、白介素IL-6的含量显著高于A组(P<0.05)；与B组比较，C组大鼠TNF-α、IL-6的含量均降低(P<0.05)；与D组比较，E组大鼠TNF-α、IL-6的含量均降低(P<0.05)。详见表4～5。

表4 各组大鼠4周后TNF-α、IL-6的检测结果

表5 各组大鼠8周后TNF-α、IL-6的检测结果

2.3 “双固一通”艾灸法对各组大鼠肝脏胰岛素抵抗 mRNA表达的影响

肝脏InsR mRNA扩增曲线见图1。B组和D组肝脏胰岛素受体InsR表达明显低于A组(P<0.05)；C组与B组相比，InsR表达明显增加(P<0.05)；E组与D组相比，InsR表达明显增加(P<0.05)。详见表6。

图1 肝脏InsR mRNA扩增曲线

表6 各组大鼠InsR mRNA表达的影响

3 讨论

中医学将糖尿病称之为“消渴”。糖尿病周围神经病变在古医籍中无确切的病名，但长期以来糖尿病周围神经病变与“消渴”都是密切联系在一起的。《黄帝内经》时期已较为详细的记载了消渴的病因、病机、症状等相关内容。《黄帝内经》云：“此肥美之所发也，引人必数食甘美多肥也。肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。”明确指出消渴病的病因和病机，而这些传统论述与现代医学研究所发现的饮食失控可诱发糖尿病的理论完全吻合。唐代初期著名医家甄立言《古今录验方》记载消渴临床症状为“渴而饮水多，小便数，无脂似麸片甜。”王焘《外台秘要》指出:“消渴者，每发小便至甜。”《黄帝内经·素问》所云：“脾病不能为胃行其津液，四肢不得禀水谷之气，气日以衰，脉道不利，筋骨肌肉皆元气以生。”说明糖尿病周围神经病变的临床表现是以四肢麻木不仁为主；而脾虚，化生津液不足，营阴亏耗，从而引起气血亏虚，不能濡养筋脉而导致四肢不温而痛；气虚血行不畅，久而成瘀。

中医针灸“治未病”理论强调以正气为本，固护先天与后天是其基础和关键，并且通过“治”达到“防”的目的，换句话说，“治”是积极的、主动的“防”。对于“防”，其意义有三，一是预防疾病，二是疗疾防变，三是调节机能。总而言之，针灸“治未病”的本质特征是“固护正气、以治为防”[6]。“双固”即固护人体先天之本和后天之本，“一通”即通泻病邪。足三里为胃经合穴，胃腑之下合穴，针之可调理脾胃补益气血生化之源，固护后天之本；关元为任脉腧穴，也是三阴经与任脉交会穴，为元阴、元阳关藏出入之所，针之可益精补气、扶助人体先天之本。足三里、关元配合，兼顾先天和后天，补益正气，再与治疗消渴的效穴胰俞相配伍，则可达到以治为防、防微杜渐的目的[7]。“双固一通”针灸法以中医发病学和防治学理论为基础，坚持“未病先防，既病防变”的中医“治未病”治疗原则，注重调动机体整体的潜在能力，以治为防，防治结合[8]。

灸法在对糖尿病及其并发症的防治方面也有极为丰富的记载。《千金翼方》载：“消渴咽喉干，灸胃管下俞三穴各百壮，穴在背第八椎下横三寸，间寸灸之”。又有“食不充饥灸三里”之说。在现代临床研究方面，对糖尿病患者采用逢时灸法[9-10]、温针隔橘皮灸[11]可明显降低患者血糖。也有学者发现，在治疗糖尿病周围神经病变上，运用温和灸治疗后患者空腹血糖、糖化血红蛋白、NO、丙二醛与血浆内皮素均有明显改善，且与西药组有明显差异[12]。亦有报道称通过温针灸法可以显著改善DPN患者的麻木、疼痛等症状，改善MNSI量表评分，提高神经传导速度[13]。在现代动物实验方面，李石良等[14]观察到艾灸可良性调节NIDDM大鼠脂代谢紊乱。另有学者曹某[15]表明艾灸可更有效的清除自由基，发挥胰岛素(INS)的作用，改善患者的代谢状态。

2型糖尿病及周围神经病变都存在着一定程度的脂代谢紊乱[16]，本实验也证实了这一观点。这是由于胰岛素分泌和作用的缺陷，导致脂代谢异常，出现高血糖、高甘油三酯血症、高胆固醇血症等，引发出多种并发症[17]。有研究表明，胰岛素抵抗是2型糖尿病发生的始动环节[18-19]。胰岛素抵抗是指胰岛素分泌量在正常水平时，刺激靶细胞摄取和利用葡萄糖的生理效应显著减弱，或者是靶细胞摄取和利用葡萄糖的生理效应正常进行，但需要超常量的胰岛素，从而产生的一系列病理和临床表现[20]。脂肪分解代谢过程受到激素敏感性脂肪酶(HSL)与脂肪组织甘油三酯脂酶调控[21]，而胰岛素抵抗使脂肪组织的激素敏感脂酶活性增强，使脂肪组织释放大量游离脂肪酸，后者进入肝脏成为合成TG、TC及极低密度脂蛋白(VLDL)的原料；胰岛素抵抗还使脂蛋白酯酶活性减低，LDL受体功能减退或负荷加重，使富含TG的脂蛋白清除减慢，滞留于血循环，在胆固醇转运蛋白的作用下，HDL、LDL中的胆固醇与VLDL和乳糜微粒间的TG交换加速，使HDL-TG增加，在活性增高的肝脏甘油三酯酶作用下，HDL中的胆固醇成分减少，造成TG升高、HDL胆固醇降低[22]。LDL与VLDL间的TG与胆固醇酯的转运形成了富含TG的LDL颗粒，后者易于被肝脂酶水解，形成小而密的脂蛋白，易被氧化[23]，更易导致多种并发症的产生。综上所述，改善胰岛素抵抗，可以在一定程度上控制血脂紊乱，对治疗糖尿病及并发症有重要意义。

TNF-α、IL-6为调节体内免疫功能和代谢过程的细胞因子，主要由活跃的单核巨噬细胞受脂多糖的刺激而产生。近期的研究显示，2型糖尿病患者均存在高胰岛素血症及免疫反应。长期的不良刺激导致机体固有免疫系统适应不良，非特异性免疫系统被激活，单核细胞、巨噬细胞、T细胞、脂肪细胞和内皮细胞等产生大量细胞因子(主要是TNF-α、IL-6)，导致胰岛β细胞分泌功能受损及产生胰岛素抵抗[24-26]。

现代研究发现，2型糖尿病的主要病理特征是胰岛细胞的胰岛素分泌功能缺陷和胰岛素抵抗[27]。大多数糖尿病患者发生胰岛素抵抗的分子机制是靶细胞胰岛素受体后信号传导通路的缺陷所导致[28]。胰岛素与受体的α亚基结合后，在使β亚基的酪氨酸残基自身磷酸化的同时使胰岛素受体底物的多个酪氨酸残基发生磷酸化，将信号下传。β亚基具有特异的酪氨酸激酶(Tyrosine kinase，TK)活性的区域，TK能催化ATP的γ-磷酸基转移到受体蛋白酪氨酸残基上，引发细胞内一系列蛋白底物磷酸化或去磷酸化的级联反应，介导胰岛素的生物学效应。因此，InsR中TK异常是产生胰岛素抵抗的重要原因[29]。近年有研究发现，胰岛β细胞也同样存在胰岛素信号通路，这也越发促进了人们对β细胞胰岛素信号转导研究的重视[30]。现代研究表明，模型组大鼠肝脏胰岛素受体mRNA表达明显低于正常水平[31]。

本实验研究结果发现，“双固一通”艾灸法治疗后，改善了糖尿病及周围神经病变大鼠血脂紊乱的情况，使得模型大鼠血清内TNF-α、IL-6含量下降，也使得糖尿病和周围神经病变大鼠的胰岛素受体数量增加、功能增强，改变了胰岛素受体数量与功能缺陷所导致的胰岛素作用减弱的状态，进而改善胰岛素抵抗情况，这可能也是“双固一通”艾灸法防治糖尿病及糖尿病周围神经病变的作用机制之一。