通元针法联合隔药盐灸神阙对产后抑郁症模型大鼠下丘脑-垂体-性腺轴的影响*

吴晓玲，张贵锋△，李力强，曾统军，祝晓忠

(1.肇庆医学高等专科学校，广东 肇庆 526020；2.南方医科大学附属顺德医院，广东 佛山 528300；3.肇庆市中医院,广东 肇庆 526020)

产后抑郁症(Postpartum depression，PPD)是临床一种常见的继发性抑郁症，一般在孕妇产后2周左右开始出现症状，4～6周症状加重，可持续3～6个月。研究发现国内产后抑郁症发生率为13.1%～16.3%。本病不仅会严重危害到产妇的身心健康和家庭和谐，严重的甚至会出现自杀和杀婴行为，而且对婴儿生长发育、心理等有不良影响[1]。由于产后处于哺乳期，患者及其家属往往会顾虑药物对婴儿的影响，治疗依从性较差。临床观察和文献分析表明，针灸治疗产后抑郁症安全有效[2]。笔者课题组观察了运用通元针法联合隔药盐灸神阙治疗产后抑郁症的临床治疗效果，发现能显著改善患者的临床症状[3]，但疗效机制尚不完全明确。已有研究证实抑郁症患者的下丘脑-垂体-性腺轴(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)活性下降[4]；产后抑郁症属于继发性抑郁症范畴，有研究认为产后抑郁症患者的性激素水平紊乱[5]。因此，笔者课题组认为通元针法联合隔药盐灸神阙干预产后抑郁症的疗效可能与调控HPGA活性有关，通过观察该疗法对产后抑郁症模型大鼠HPGA相关激素水平的影响，探索其疗效作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康雌性SD大鼠(南方医科大学实验动物中心,生产许可证号:SYXK<粤>2016-0041)120只，3月龄，体质量(200±20)g。在实验过程中，大鼠自由摄食和饮水，术前禁食。饲养环境维持在20～22℃之间，相对湿度保持在60%～80%之间，12 h光照和12 h黑夜循环。

1.2 药品和试剂

1.2.1 药品 黄体酮注射液(批号:160803，广州白云山明兴制药有限公司)，苯甲酸雌二醇注射液(批号:160711，广州白云山明兴制药有限公司)；盐酸氟西汀胶囊(批号:4407A，礼来苏州制药有限公司)，每次灌胃前溶于蒸馏水配置成浓度为0.25 mg/mL的药液。黄芪20 g、皂角(煨)10 g、藿香15 g、石菖蒲15 g、干姜5 g、小茴香15 g、肉桂5 g、雄黄2 g、丁香10 g、苏合香5 g(肇庆医学高等专科学校附属医院中药房采购)，粗盐100 g(网络购物平台采购)，干燥以后粉碎，过80目筛，炒制成药盐备用。

1.2.2 试剂 黄体生成素(Luteinising Hormone，LH)、雌二醇(Estradiol，E2)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating Hormone，FSH)、孕酮(Progesterone，P)RIA检测试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)；促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)ELISA检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。

1.3 仪器和器材

DFM-96型放射免疫γ计数器(合肥众成机电技术开发有限责任公司);DNM-9602G酶联免疫检测仪(北京普朗新技术有限公司)；针灸毫针(规格:0.30 mm×40 mm、0.30 mm×25 mm，苏州医疗器械厂有限公司);艾绒(李时珍蕲艾，湖北蕲春艾之宝制品有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠分组

全部大鼠适应性饲养1周，根据旷场(Open-Field)实验评分结果，筛选出合格大鼠120只，采用随机数字表法随机分为空白组20只、假手术组20只、造模组80只。造模组大鼠在确认造模成功后，再随机分为模型组、药物组、常规针刺组、实验组，每组20只。在干预后的第2周末、第4周末设两个指标检测时间点，各组大鼠在每个时间点采用随机数字表法随机选取10只进行相关指标检测。

2.2 大鼠造模

造模组80只大鼠参照Galea报道的方法[6-7]进行造模。对大鼠行腹腔注射麻醉后左侧位固定在手术台上，在其脊柱旁开1横指、肋缘后1横指的部位进行备皮和消毒。先从大鼠腰椎沿背部正中线向下纵向切开1 cm左右的口子，将双侧子宫角拉出体腔外，再在卵巢下方、子宫连接处两个部位分别进行结扎，然后摘除大鼠的双侧卵巢，完成手术后将子宫体送回腹腔内缝合好，消毒切口部位并涂庆大霉素预防感染。假手术组大鼠的手术操作步骤同上，不同的是，不摘除大鼠的双侧卵巢，仅摘取卵巢周围的少量脂肪组织，尽量保护好卵巢。空白组不予任何干预处理。采用超快速改良巴氏染色法，对摘除卵巢后的大鼠做阴道细胞学涂片检测，每日检测1次，连续7 d，对于激素水平在逐渐恢复的大鼠剔除不用。选择阴道细胞学涂片检测合格的大鼠，采用注射激素的方法模拟大鼠妊娠状态下的激素分泌水平，每天定时皮下注射黄体酮4 mg、苯甲酸雌二醇0.1 mg，连续注射16 d；从第17天起，每天皮下注射苯甲酸雌二醇0.2 mg，连续注射7 d。在第24天停止注射雌激素。空白组、假手术组大鼠皮下注射植物油，每日1次，前16 d每次0.3 mL，后7 d每次0.1 mL。

2.3 各组大鼠干预方法

2.3.1 药物组 盐酸氟西汀胶囊药液以1 mL/100 g体质量灌胃。

2.3.2 空白组、假手术组、模型组 与药物组大鼠等容量的蒸馏水灌胃。

2.3.3 常规针刺组 局部常规消毒，用0.25 mm×13 mm针灸针针刺大鼠百会穴、太冲穴，刺至一定深度后均匀捻转30 s，接电针仪(G6805-Ⅰ型)，连续波，频率15 Hz，强度1 mA，以大鼠安静耐受为度，每次针刺20 min。

2.3.4 实验组 常规消毒后用0.25 mm×13 mm针灸针针刺大鼠百会穴、大椎穴、气海穴、关元穴，刺至一定的深度后均匀捻转30 s，接电针仪(G6805-Ⅰ型)，连续波，频率15 Hz，强度1 mA，以大鼠安静耐受为度，每次20 min；实验组大鼠在完成电针治疗后随即进行隔药盐灸，将大鼠神阙穴周围毛剪干净，将配置好的药盐用蒸馏水湿润后均匀铺在大鼠神阙穴的部位，然后再将小型艾炷放在药盐上施灸，灸3壮，大约20 min，每日治疗1次[8]。大鼠取穴参照《实验针灸学》[9]。

各组大鼠在干预开始后的第2周末、第4周末两个时间点进行标本采集，每次10只，先进行旷场实验，然后再处死取材。在处死之前，各组大鼠对应的干预措施均持续实施。

2.4 指标检测

2.4.1 旷场实验 以双后肢跨出方格为标准，大鼠穿越方格数作为水平活动评分；以双前肢离地1 cm为1次记分标准，直立次数作为垂直活动评分。测试全程保持室内安静，每只大鼠测试1次，每次观察5 min，记录大鼠水平活动与垂直活动评分。每完成1只大鼠测试擦净纸箱后再放入下一只大鼠。

2.4.2 HPGA相关血清生化指标检测 血清GnRH采用酶联免疫法(ELISA)检测，血清FSH、LH、E2、P采用放射免疫法(RIA)检测。各项血清指标检测方法均严格按照试剂盒的说明书进行操作。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 旷场测试结果

3.1.1 各组水平活动评分比较 在干预后的第2周、第4周，假手术组大鼠评分与空白组比较无统计学意义(P>0.05)，模型组、药物组、常规针刺组大鼠评分低于空白组(P<0.05)；实验组大鼠第2周评分显著低于空白组(P<0.05)，而第4周与空白组差异无统计学意义。第2周、4周药物组、实验组大鼠评分显著高于模型组(P<0.05)，第4周常规针刺组大鼠评分显著高于模型组(P<0.05)。干预4周后，实验组大鼠评分显著高于常规针刺组(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠干预后第2周、第4周旷场实验水平活动评分比较

3.1.2 各组垂直活动评分比较 在干预后的第2周、第4周，假手术组大鼠评分与空白组比较无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠评分显著低于空白组(P<0.05)，药物组、常规针刺组、实验组大鼠评分显著高于模型组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠干预后第2周、第4周旷场实验垂直活动评分比较

3.2 HPGA相关血清生化指标检测

3.2.1 各组大鼠不同时间点血清GnRH比较 在干预后第2周、第4周，空白组、假手术组大鼠血清GnRH水平差异无统计学意义(P>0.05)，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清GnRH水平显著高于模型组(P<0.05)；第2周，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清GnRH水平差异无统计学意义(P>0.05)，且均显著低于空白组(P<0.05)；第4周，实验组大鼠血清GnRH水平与空白组差异无统计学意义(P>0.05)，但显著高于药物组、常规针刺组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠干预后第2周、第4周血清GnRH变化

3.2.2 各组大鼠不同时间点血清LH比较 干预后第2周、第4周，空白组、假手术组大鼠血清LH水平差异无统计学意义(P>0.05)，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清LH水平显著低于模型组(P<0.05)；第2周，常规针刺组、实验组大鼠血清LH水平显著高于空白组(P<0.05)，药物组大鼠血清LH水平与空白组差异无统计学意义(P>0.05)；第4周，药物组、常规针刺组、实验组、空白组大鼠血清LH水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠干预后第2周、第4周血清LH变化

3.2.3 各组大鼠不同时间点血清FSH比较 干预后第2周、第4周，空白组、假手术组大鼠血清FSH水平差异无统计学意义(P>0.05)，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清FSH水平显著低于模型组(P<0.05)；第2周，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清FSH水平差异无统计学意义(P>0.05)，但均显著高于空白组(P<0.05)；第4周，实验组、药物组大鼠血清FSH水平与空白组差异无统计学意义(P>0.05)，但显著低于常规针刺组(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠干预后第2周、第4周血清FSH变化

3.2.4 各组大鼠不同时间点血清E2比较 干预后第2周、第4周，空白组、假手术组大鼠血清E2水平差异无统计学意义(P>0.05)，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清E2水平显著高于模型组(P<0.05)；第2周，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清E2水平差异无统计学意义(P>0.05)，显著低于空白组(P<0.05)；第4周，实验组大鼠血清E2水平与空白组差异无统计学意义，显著高于药物组、常规针刺组(P<0.05)。见表6。

表6 各组大鼠干预后第2周、第4周血清E2变化

3.2.5 各组大鼠不同时间点血清P比较 干预后第2周、第4周，空白组、假手术组大鼠血清P水平差异无统计学意义(P>0.05)，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清P水平显著低于模型组(P<0.05)；第2周，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清P水平差异无统计学意义(P>0.05)，常规针刺组、实验组大鼠血清P水平显著高于空白组(P<0.05)；第4周,药物组、常规针刺组、实验组、空白组大鼠血清P水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表7。

表7 各组大鼠干预后第2周、第4周血清P变化

4 讨论

产后抑郁症动物模型的抑郁症状评价一般沿用抑郁症动物模型的相关方法，目前公认的有旷场实验、糖水消耗实验、强迫游泳实验等行为学评价方法，研究表明正常大鼠旷场实验水平及垂直活动均有较高评分[10]。在本研究中，与空白组比较，造模组大鼠旷场实验的水平评分、垂直活动评分显著降低，假手术组无显著差异，提示造模成功。经过2～4周的干预以后，与模型组比较，药物组、常规针刺组、实验组大鼠旷场实验的水平评分、垂直活动评分显著提高，表明3种干预方法均能有效改善产后抑郁症模型大鼠的抑郁症状。

HPGA轴分泌的激素包括下丘脑分泌的GnRH、LH、FSH以及性腺分泌的E2、P等等。已有研究表明，抑郁症患者HPGA轴功能紊乱，主要表现为 HPGA 活性下降[11]。李丽丽等[12]发现中药复方能够改善围绝经期抑郁症模型大鼠活动度降低情况，同时抑制血清FSH、LH的过渡分泌，使E2保持接近正常生理水平，认为中药复方是通过调控HPGA轴产生抗产后抑郁症作用。Ciechanowska M等发现，急慢性心理应激状态下丘脑GnRH及GnRH受体mRNA水平显著下降[13]。吴萍等[14]发现，围绝经期抑郁症女性FSH和LH显著高于围绝经期无抑郁症女性和正常育龄期女性，E2浓度显著低于围绝经期无抑郁症女性和正常育龄期女性。高鹏等[15]发现产后抑郁症妇女血中P水平较无产后抑郁症妇女高，认为产后体内激素水平的急剧变化可能是产后抑郁症发生的生物学基础。

在本研究中，模型组大鼠血清GnRH、E2水平显著低于空白组，LH、FSH、P水平显著高于空白组，这与相关研究结果一致[12-15]，提示产后抑郁症可能与HPGA轴相关激素血清GnRH、LH、FSH、E2、P的代谢紊乱关系密切。经过2～4周的干预后，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清GnRH、E2水平显著高于模型组，血清LH、FSH、P水平显著低于模型组，表明盐酸氟西汀、电针百会穴及太冲穴、通元针法联合隔药盐灸神阙穴都可以调控产后抑郁症模型大鼠HPGA轴相关激素。干预后第2周，药物组、常规针刺组、实验组大鼠血清GnRH、FSH、E2、P水平无显著差异，与模型组、空白组比较差异均有统计学意义，表明经过2周的干预治疗，产后抑郁症模型大鼠激素水平趋向恢复正常，但尚不能恢复到正常水平，3种干预方法作用效果相当。干预后第4周，实验组大鼠血清GnRH、LH、FSH、E2、P水平与空白组比较差异无统计学意义，表明通元针法联合隔药盐灸神阙穴能将产后抑郁症模型大鼠紊乱的激素水平调控至正常水平范围内；实验组大鼠血清GnRH、E2水平与药物组比较差异无统计学意义，实验组大鼠血清GnRH、FSH、E2水平与常规针刺组比较差异有统计学意义，提示通元针法联合隔药盐灸神阙穴对产后抑郁症模型大鼠激素水平的调控效果要优于盐酸氟西汀、电针百会穴和太冲穴，但需要较长的治疗时间。

产后抑郁症属于中医“郁证”“脏躁”等范畴，《妇人大全良方》曰:“产后气血大伤，心神易浮，不耐惊恐忧悲”，因此本病主要是产后精血亏虚、气血失和、阴阳失调、五脏失于濡养乃至五志之火内动扰乱神明所致。“通元针法”是广东省名中医、全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师赖新生教授创立的一种新型针刺方法，全称为“通督养神、引气归元针法”，赖新生教授认为，脏腑经络之气阴阳相应、腹背之气交互贯通，针刺治疗应当调气，而调气的关键在于引气归元。“阴病治阳、阳病治阴”，阴病当取在阳之背俞穴，阳病当取在阴之腹募穴，如果二者兼而取之，则达到阴阳二气贯通归元的作用，实现阴平阳秘[16]。临床研究表明，通元针法治疗产后抑郁症、抑郁性神经症疗效显著[3,17]。《证治汇补·郁证》曰:“郁病虽多，皆因气不周流，法当顺气为先。”任脉为阴脉之海，督脉为阳脉之海，是调节全身气血阴阳的关键，笔者课题组选取督脉的百会、大椎两穴通督养神，选择任脉的气海、关元两穴引气归元，四穴共同发挥调和气血、燮理阴阳的作用。神阙穴与任脉、督脉、冲脉关系密切，冲脉、任脉、督脉一源三岐、同出胞中，研究表明神阙穴隔盐灸对妇科疾病有良好疗效[18]。为了加强灸神阙的效果，在药盐中以藿香和石菖蒲芳香化浊、行气疏肝，以干姜、肉桂、丁香和小茴香温补脾肾、疏通经络，以煨皂角和苏合香通络开窍、通闭醒脑，以雄黄和黄芪温阳化气。运用药盐灸神阙穴，能够同时发挥了灸疗、药疗、脐疗的多重作用，整体上达到温阳补气、培肾固本的作用。此外，妇人产后多瘀多虚，隔药盐灸神阙穴既能芳香行气、活血通络，又能补脾益肾、补而不滞、调畅气血，有助于产后诸症的康复。

综上所述，盐酸氟西汀、常规针刺、通元针法联合隔药盐灸神阙穴3种治疗方法都能有效改善产后抑郁症模型大鼠的抑郁症状，对大鼠血清GnRH、LH、FSH、E2、P有显著调控作用，但是通元针法联合隔药盐灸神阙穴的效果更明显，推测本法治疗产后抑郁症可能与调控HPGA轴相关激素水平相关。由于产后抑郁症患者血清激素水平变化并不完全一致，相关研究的指标结果甚至相反，需要进一步优化检测指标。