根管内壁交联壳聚糖纳米颗粒对纤维桩粘接质量的影响*

熊 洁 谌礼佩 江青松

胶原纤维的稳定性对于脱矿牙本质表面的粘接界面完整性具有巨大影响，尤其在多年行使功能后尤为重要[1]。粘接剂层下暴露的牙本质胶原纤维易于受到细菌和宿主源性的金属基质蛋白酶的攻击，成为粘接持久性的薄弱环节[2,3]。近年来，研究者对于提高粘接界面稳定性进行了多种方法的尝试，交联剂的使用被证明具有明显积极影响[4-7]。它可以通过分子内和分子间的联结提高胶原纤维的机械和生物稳定性，从而稳定粘接界面。戊二醛是一种最有效并广泛使用的交联剂，但是，其残余物具有很高毒性，无法用于人体[8,9]。碳二亚胺（EDC）作为一种无毒的交联剂也出现在许多研究中，但其作用较弱[10,11]。交联技术可以用于将天然生物聚合物整合至胶原纤维中以提高机械性能[12-14]，壳聚糖就是其中之一[15,16]。壳聚糖是一种具有多种性能的亲水性聚合物,其大量的羟基与氨基基团可以与胶原及胶原酶形成化学结合,直接阻止胶原纤维上与酶的结合位点或是直接抑制胶原酶的活性,从而直接提高纤维的抗降解性能[17];同时,它也可以粘接至具有负电荷的细菌细胞,改变了细胞膜的通透性直至死亡,因此具有抗菌性能[18,19]。已有研究证实Csnp处理的交联牙本质胶原纤维展现出更好的机械属性和更高的抗酶解性[13]。根管内纤维桩的粘接界面在长期使用后容易出现纤维降解,形成细菌的侵入通道,更进一步加剧粘接界面完整性的破坏。因此,本研究旨在观察根管牙本质在Csnp和EDC的作用下对纤维桩在根管内的粘接质量的影响。

1.材料与方法

1.1 牙体收集 收集38颗单根管离体人牙,纳入标准为无龋坏、无裂纹的上颌前牙及单根管的前磨牙,消毒后置于4 ℃氯化钠溶液中,三个月内使用。

1.2 根管预备和桩道预备 在釉牙骨质界处去除牙冠部,清理通畅根管,10#K（马尼,Tichigi,日本）钻确认工作长度,镍钛Protaper（登士柏,瑞士）预备根管至F3后用Macro-lock标准钻（RTD,法国）预备桩道至#4,每次更换钻时以1%NaCIO和17%EDTA交替冲洗,最后大量生理盐水冲洗待用。

1.3 试剂制备 所有化学试剂均购于Sigma公司。Csnp是基于前期研究文献合成[20],溶于去离子水中,形成1 mg/ml溶液。细菌酶（P/N C-0130）溶于含0.36mM CaCl2的50mM HEPES 缓冲液中,形成0.1 mg/ml酶溶液。33mM交联剂EDC、8mM NHS以及50mM的MES缓冲液溶于40%的乙醇中,形成EDC交联剂溶液。

1.4 试件处理 所有牙根以32%磷酸（UNIETCH,Bisco,美国）酸蚀15s,冲洗20s,吹干,随机选取2颗牙根,分别进行Csnp预处理：A：将牙根静置于Csnp溶液中1 min后轻轻冲洗;B：将牙根置于Csnp溶液中超声作用1 min后轻轻冲洗,随后均经EDC交联剂作用24h,然后冲洗10s。抽真空干燥后,喷金,进行电镜观察。其余牙根进行粘接试件处理：根据粘接剂处理方式不同36颗牙分为三组（n=12）：A：浸泡在戊二醛溶液中24h;B在Csnp溶液中超声作用1 min,轻轻冲洗,浸泡至EDC中24h,冲洗;C：无预处理（对照组）。分组处理完成后,使用商品粘接剂All-Bond 3A、B液均匀混合,小毛刷涂粘接剂20s,气枪轻吹15s后光照固化,之后使用Duo-link（Bisco,Schaumburg,美国）进行根管内纤维桩（Macro-lock,RTD,法国）粘接。所有粘接操作由同一人完成。固化后,所有样本置于去离子水中24h后进行粘接质量的评价。

1.5 粘接质量的评价

1.5.1 粘接界面电镜观察 每组取一个牙根横向切割1 mm厚牙片4片进行界面观察。所有试件进行酸蚀、冲洗、然后置于5%次氯酸钠溶液10 min,冲洗20s。梯度酒精脱水后吹干,进行SEM评估。

1.5.2 原位聚合转化率（DC）每组取2个牙根,每个牙根水平向切割出4片1.0 mm左右厚度的薄片进行粘接剂聚合转化率的评价。将切片依次在600,800, 1500目砂纸上进行打磨后,使用5.25%次氯酸钠擦拭,超声清洁10 min,然后保存24h后置于拉曼光谱显微镜（LabRAM HR Evolution, Horiba Scientific, 日本)。校对系数后,每个样品取4个标准位点在1.5mW,波长532 nm的半导体激光下进行分析。空间分辨率0.1 μm,积累时间60s,放大倍数50倍。每个试件取900 cm-1and 2400 cm-1范围内图谱,以Origin Pro 2018进行相关分析。将未固化的粘接剂置于玻璃板上进行光谱分析作为基数。双键的聚合转化率根据下列公式进行计算：DC (%)=(1-［R 固化后/R 未固化］)×100%,R指脂肪族和芳香族在1637 cm-1处和1608 cm-1处波峰强度。

1.5.3 粘接强度 剩余27个牙根在根管上、下两个部位以慢速切割机横向截取1 mm左右厚度的牙片进行粘接强度评价。每个水平各2片,分别进行以下两种处理：a. 即刻组：即刻测试粘接强度;b. 水解组：放置于0.1 mg/ml的胶原酶中72h后测试粘接强度。千分尺精确测量每个牙片的厚度和根管内径至0.01 mm。粘接面积由以下公式计算：A=π(R+r)√(R-r)2+h2。

π是常数3.14,R是上截面的内半径,r是下截面的内半径,h是试件的精确厚度。

将试件置于特制模具上通过万能试验机加载力（10 kg,1.0 mm/min）,计算各组粘接强度：P=N/A,

p是粘接强度MPa,N是脱粘接力N,A为粘接面积mm2

1.6 统计学分析 统计分析均采用SPSS20.0（a=0.05）,聚合转化率、粘接强度使用方差分析和SNK-test进行统计分析。

2.结果

2.1 牙本质表面SEM观察 不同方式Csnp预处理后根管牙本质内壁表面见图1。可见静置方式下Csnp纳米颗粒仅有少量聚集成团的颗粒吸附在暴露的胶原纤维表面，大部分胶原纤维未见Csnp的吸附联结（图1-A）。超声作用下，Csnp在根管内壁表面分布较均匀，大部分暴露的胶原纤维网均可见纳米颗粒的结合覆盖，且较少出现团聚现象（图1-B）。

图1 .Csnp预处理后的根管内壁

2.2 粘接界面电镜观察 电镜观察结果可见图2。如图所示：在各实验组中均可观察到典型的混合层与树脂突，也有部分试件的混合层可观察到不连续、厚度不均一，甚至部分缺如，牙本质/粘接剂界面可观察到在树脂突及混合层下出现间隙。Csnp预处理组个别试件可观察到树脂突与混合层中Csnp纳米颗粒，其余实验组间未见明显差异。

图2 .粘接界面的电镜观察

2.3 粘接强度 各实验组的粘接强度可见表1。各实验组微推出粘接强度范围从5.85-13.35Mpa。对照组在胶原降解后的粘接强度最低；Csnp预处理组的即刻粘接强度最高。就粘接方式而言，各组的即刻粘接强度没有显著差别（P=0.123），但胶原酶的降解使各实验组的粘接强度均有降低（P=0.001），其中对照组以51.1%的比例降低最多。A组和B组的降低分别为29.2%和34.1%。

表1 .各实验组微推出粘接强度（均数±SD)

2.4 聚合转化率评价 统计结果显示各组间的树脂粘接剂的聚合转化率没有显著差异（P=0.552），范围为81.3%-83.3%。无论戊二醛还是Csnp、EDC的预处理，对于根管牙本质的粘接剂的聚合固化，并没有产生显著影响。

表2 .各实验组的粘接界面的树脂聚合转化率（均数±SD)

3.讨论

本研究的结果显示Csnp 与交联剂EDC 对根管内壁的作用可以提高粘接界面的胶原纤维对酶解的抵抗性，稳定粘接强度，且对粘接剂的聚合转化率无显著影响。

前期研究中显示：Csnp 与胶原纤维溶液的反应是基于正负电荷的分子间相互吸引，形成一个典型聚合物[18]。但是，当Csnp 溶液作用于脱矿牙本质暴露的胶原纤维时，其相互之间的作用可能不完全相同。SEM（图1）显示Csnp 的作用方式对于其与脱矿牙本质的胶原纤维的联结具有影响。当脱矿牙本质在Csnp 溶液中静置1 min 时电镜显示Csnp 纳米粒子聚集成团，稀疏的散落在牙本质表面；而超声作用1 min 使得Csnp 明显密度增多，颗粒变小，较均匀的分散在脱矿牙本质表面暴露的胶原纤维上。超声因素在根管内已被广泛应用于清理、杀菌、传输等各个方面，而对于Csnp 纳米颗粒在根管内壁的分布与结合的影响，其原因可能在于超声能量产生的声流和辐射压力可能有助于阻止纳米颗粒的聚集结团，并有助于颗粒对深层次的渗入，增加接触频率和时间，利于其在牙本质表面更均一的分布。

Csnp 在牙本质表面与胶原纤维的结合会给与纤维桩的粘接界面带来以下方面影响。首先，前期的基础研究表明，Csnp 可以与胶原纤维结合，并与胶原纤维酶反应，降低纤维的降解[16]。在此基础上，我们认为结合至牙本质表面的Csnp 会降低粘接界面的纤维降解，稳定粘接强度。粘接强度的实验结果证明了这种想法。统计分析表明：交联剂与Csnp的预处理对各试验组的即刻粘接强度并无显著影响，但胶原酶作用72h 后，各组之间产生显著差异，对照组降低量最多，明显高于两个实验组，说明交联剂或Csnp 对粘接界面的纤维起了保护的作用，降低其降解量，提高了纤维对胶原酶的抵抗，从而在胶原酶的作用下，其粘接强度降低量较少。而另一方面，在涂布粘接剂之前，粘接界面结合的Csnp对粘接剂固化是否影响，对粘接界在胶原纤维网的渗透是否影响，是需要评价的方面。从实验结果可以看出，各实验组的聚合转化率没有统计学差异，反映Csnp 与交联剂的预处理并没有干扰到粘接层的固化，而粘接界面的SEM 照片显示，各组均可观察到树脂渗透形成树脂突，Csnp 组的部分试件可观察到纳米颗粒混合在粘接界面和树脂突中（见图2），其余未见明显组间差异。此外，各实验组的即刻粘接强度未见明显差异，也从侧面证明各实验组的牙本质粘接面预处理（戊二醛，Csnp/EDC）并未对粘接剂固化和树脂在管壁牙本质的渗透产生影响。