无机盐与激素混合对土沉香结香的诱导*

宋晓琛 王西洋 杨 光 黄桂华 周再知 梁坤南 张青青

(1.中国林业科学研究院热带林业研究所 广州 510520； 2.江西省林业科学院 南昌 330032)

土沉香(Aquilariasinensis)，别名白木香，为瑞香科(Thymelaeaceae)沉香属(Aquilaria)常绿乔木，我国特有药源植物(中国科学院中国植物志编辑委员会， 1999)，天然分布于海南、广东、广西、福建、台湾等省(区)(康月惠等， 2012)。沉香是沉香属植物受刺激或损伤后产生的次生代谢物，是传统的名贵药材，中医认为沉香性微温，味辛、苦，具有降气、调中、暖肾、止痛、肌松之功效，现代研究认为沉香具有降压、镇静、镇痛、抗心律失常和抑制中枢系统兴奋等作用(张争等， 2010)。沉香亦是名贵的天然香料，富含的挥发油成分使其香气浓郁。由于沉香的经济价值高，市场需求量大，20世纪70年代以来，大量掠夺式砍伐采香使土沉香野生资源遭到严重破坏，大树已少见，仅剩零星散生的残存植株。1999年，土沉香被列为国家二级重点保护野生植物； 2000年，被列入《世界自然保护联盟受威胁植物红色名录》。当前，随着沉香市场价格上涨，土沉香人工种植面积不断增加，但土沉香天然结香往往需要经历漫长的外部随机干扰过程，产量低，且不一定结香。因此，为提高沉香产量，满足市场需求，人工诱导成为促进土沉香结香和提高结香量的有效途径。

氯化钠、甲酸或亚硫酸钠(Thanhetal.， 2015； 王磊等， 2011)、乙烯利、茉莉酸甲酯(MJ)或水杨酸(SA)(Okuderaetal.， 2009； Wijitphan， 2009； 魏建和等， 2010a)均可诱导土沉香结香。Blanchette等(2009)成功筛选出对沉香属植物木质部活细胞有伤害作用的化学物质，包括氯化钠、亚硫酸氢钠、氯化亚铁、氯化铁、甲酸、甲壳素、酵母提取物、纤维二糖、水杨酸和铁粉，其将亚硫酸氢钠、酵母提取物和铁粉以1∶ 1∶ 3比例混合进行结香处理，取得较好效果。王磊等(2011)研究发现，将pH 1.5～3.0的甲酸、乙酸或磷酸二氢钠单独注入白木香木质部，诱导12个月时结香量较少且颜色较浅，而注入甲酸、乙酸或二者混合液与磷酸二氢钠溶液，则可大面积结香。王之胤(2013)研究指出，茉莉酸甲酯、乙烯利及其混合液均能诱导白木香产生脂类物质，且相同浓度的混合液处理效果最佳，茉莉酸甲酯次之，乙烯利最差。马华明(2013)研究表明，氯化钠和茉莉酸甲酯均可诱导土沉香结香，但氯化钠诱导处理沉香醇溶性浸出物含量更高。

目前，无机盐与激素混合诱导土沉香结香方面的研究鲜见报道，仅有2项授权专利(魏建和等， 2010b； 梅文莉等， 2014)介绍了诱导组合及其浓度配方。本研究采用与上述专利不同的无机盐(NaCl和 FeSO4)和激素(茉莉酸甲酯和乙烯利)浓度并增添CaCl2溶液，对10年生土沉香进行无机盐与激素混合诱导处理，观测木芯变色范围、生理、组织化学及组织结构内含物变化，探明无机盐与激素混合配比对土沉香结香的影响，揭示其结香机制，以期为促进土沉香结香奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

试验地位于广东省惠州市博罗县横河镇老圩村(23°N，114°E)，属亚热带季风气候区。年均气温21.8 ℃，年均降水量1 814 mm，年均日照 2 023 h，1月均温12.8 ℃，7月均温28.4 ℃，常年基本无霜。土壤为花岗岩发育的山地红壤。10年生土沉香人工林平均胸径(10.58±0.59) cm，平均树高(5.82±0.21) m。

1.2 研究方法

1.2.1 试验设计 采用均匀试验设计，以NaCl、FeSO4、CaCl2、茉莉酸甲酯和乙烯利为诱导因子，每个因子3个水平，共5种处理(表1)，每处理5株小区，3次重复，计15株，以注射等量去离子水为对照。2017年7月，选择晴朗天气，使用4 mm钻头在树干两侧距地面30 cm处分别钻孔，用输液方式输入配制好的处理液250 mL。分别在诱导处理后0.5、1、3、6、10个月时，每处理选取3株取样。

表1 无机盐与激素组合诱导处理

1.2.2 测定方法 1) 淀粉与可溶性糖含量测定 用内径0.5 cm的生长锥在2个滴注孔上方分别钻取2根木芯，其中一根除去白木和腐木部分，用球磨仪研磨成粉。分别采用改良的硝酸钙法和蒽酮-硫酸比色法测定淀粉和可溶性糖含量(魏芳等， 2014)。

2) 切片组织化学观察 将上述钻取的另一根木芯置于FAA固定液中，按横切面和径切面采用改良的石蜡切片法(蔡海滨等， 2015)固定后，利用莱卡滑动切片机(Leica RM2255,Germany)制作厚度10 μm切片，用苏丹Ⅲ染色。高清数码相机(Pixera Pro 600ES，USA)光学显微镜(Olympus BX51，Japan)拍照并观察切片组织化学变化情况。

3) 组织结构内含物观察 将FAA固定好的木芯依木材三切面(横切、径切、弦切)分别制成2 mm厚薄片，放入真空室内，用离子溅射仪(JEC-1600，Japan)喷金2次，每次60 s、喷金流30 mA。喷金后，将样品固定在样品托钢柱上，置于扫描电镜(JSM-6510LV，Japan)中真空扫描，拍照观察。

4) 木芯变色范围测定 诱导处理后3、6、10个月时，沿树干径向方向，用内径0.5 cm的生长锥在滴注孔上方每隔5 cm钻取木芯，至木芯全为白木为止。分别测定滴注孔横向变色深度及孔上纵向变色长度。在滴注孔上方5 cm处取厚度5 cm、半径3 cm的半圆片，测定横向变色宽度。

5) 醇溶性浸出物含量测定 分别于处理后6和10个月时，在滴注孔上方5 cm处取5 cm厚半圆片，除去白木和腐木的样品置于40 ℃恒温鼓风干燥箱中烘至恒干，打磨成粉，参照《中国药典》(中华人民共和国药典委员会， 2015)采用乙醇热溶法测定醇溶性浸出物含量。

1.2.3 数据统计与分析 采用Excel软件进行试验数据处理，运用SPSS19.0和DPS(V7.05)软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 诱导处理对土沉香淀粉和可溶性糖含量的影响

随诱导时间增加，各处理淀粉含量先降低后升高(图1)。处理2在第6个月时淀粉含量降至最低值，而其他处理则在第3个月时降至最低值。当淀粉含量降至最低值时，各处理与对照之间差异显著，其他时间点差异不显著。

不同处理下可溶性糖含量变化如图2所示。处理后0.5～3个月内，处理1、3、4和5可溶性糖含量缓慢上升； 第6个月时，这4种处理均达到峰值，但处理5升幅最小，随后急剧下降。而处理2则表现为第1个月内先小幅度降低，后持续上升，第6个月时达到峰值且高于其他处理。仅在处理6个月时各处理可溶性糖含量显著高于对照，其他时间点尽管高于对照但差异不显著。

图1 不同处理下淀粉含量变化

图2 不同处理下可溶性糖含量变化

对比淀粉和可溶性糖含量变化发现，处理2淀粉含量降至最低值和可溶性糖含量升至峰值的时间相同，而其他处理则相对滞后，说明处理2诱导使淀粉转化为可溶性糖速度快，新陈代谢能力强，更有利于结香。

2.2 土沉香切片组织化学变化

经染色后，各处理土沉香木芯切片组织内油脂类物质呈棕黄色(图3)。处理3个月时，处理2射线薄壁细胞和轴向薄壁细胞内含有油脂，其他处理细胞内油脂类物质几乎没有。处理6个月时，处理1、2和3射线薄壁细胞和轴向薄壁细胞内油脂类物质含量增多，而处理4和5仅有少量油脂类物质可见。处理10个月时，各处理射线薄壁细胞和轴向薄壁细胞内继续积累油脂类物质，同时在导管内可见。由此可知，油脂先在薄壁细胞内形成，随后在导管和薄壁细胞内积累。

图3 不同处理下油脂染色变化过程

2.3 土沉香组织结构内含物变化

未处理前，土沉香茎木质部导管内未见任何形态内含物(图4A)，但射线薄壁细胞内含有大量淀粉粒(图4B、C)。经诱导处理后(以处理2为例)，射线薄壁细胞内淀粉粒逐渐消失，木薄壁细胞内侵填物质开始积累(图4D)，通过导管-薄壁细胞间半具缘纹孔进入相邻导管内(图4E、F)，油脂类物质或侵填体在导管内或傍管薄壁细胞内积累至完全堵塞(图4G-I)。由此可知，结香过程可能与射线薄壁细胞内淀粉粒含量变化有关。

2.4 诱导处理对木芯变色范围的影响

2.4.1 横向变色宽度 不同处理下横向变色宽度的变化如图5所示。处理3个月时，各处理间差异显著，处理2变色宽度最大，是处理1的2.3倍。处理6个月时，处理1、2、3与处理4、5之间差异显著，处理1变动幅度最大，其横向变色宽度较处理3个月时增加1倍。处理10个月时，处理2与处理3、4、5之间差异显著，横向变色宽度依次为处理2>处理1>处理3>处理4>处理5； 处理2横向变色宽度达1.73 cm。与处理6个月相比，处理10个月时的横向变色宽度虽有所增加，但差异不显著，这表明诱导剂的持续诱导效果有所下降。CK诱导下土沉香木质部始终不变色。

2.4.2 横向变色深度 由图6可见，不同诱导处理土沉香横向变色深度变化趋势与横向变色宽度略有不同。处理3个月时，处理4与其他处理之间差异显著，处理4诱导变色深度最小，只有0.57 cm，说明其诱导作用在前期较差。处理6个月时，处理2、3、4与处理1、5之间差异显著。与处理3个月相比，除处理5外，其他4种处理差异显著，其中处理4增幅最大，是3个月时的3.6倍。处理10个月时，处理2与处理3之间差异不显著，但均显著高于处理1、4和5； 处理2的横向变色深度最大，为3.93 cm，是处理6个月的1.64倍，其次为处理3(3.7 cm)和4(2.67 cm)，分别是处理6个月的1.61和1.32倍； 处理5的横向变色深度最小，只有1.53 cm。处理5处理3、6和10 个月之间横向变色深度差异不显著，说明该处理诱导效果不佳。

2.4.3 纵向变色长度 不同处理下纵向变色长度随时间变化差异显著(图7)。处理3个月时，处理3纵向变色长度显著高于其他处理，处理3的最长(23.67 cm)，处理5的最短(7.67 cm)。处理6个月时，处理2的纵向变色长度显著高于其他处理。处理10个月时，处理2变色长度最长，纵向变色长度达77 cm，是处理6个月的1.65倍； 处理5变色长度最短，仅45 cm，诱导效果最差。

图6 不同处理下横向变色深度的变化

图7 不同处理下纵向变色长度的变化

2.5 醇溶性浸出物含量及最适配比浓度

不同处理下土沉香醇溶性浸出物含量见表2。处理10个月时，5种处理醇溶性浸出物含量均明显增加，分别是处理6个月的1.65、1.72、1.24、1.78和1.53倍，且均显著高于对照。处理2在处理6个月和10个月时醇溶性浸出物含量均最高，分别为11.07%和19.07%，显著高于其他处理，处理5醇溶性浸出物含量均最低，分别为2.19%和3.36%。

运用DPS(V7.05)多因子逐步回归分析软件，分别以变色长度和醇溶性浸出物含量为目标值，建立与5个诱导因子(X1～X5)(因子指代见表1)的相关回归方程，以确定诱导因子最适配比浓度。

以处理10个月时的径向变色长度为目标值(Y1)建立逐步回归方程(1)，其拟合F=124.636，P=0.000 1，决定系数=0.988 2，调整后相关系数Ra=0.984 2。以处理10个月时的醇溶性浸出物含量为目标值(Y2)建立逐步回归方程(2)，其拟合F=8 181.129 5，P=0.000 1，决定系数=0.999 8，调整后相关系数Ra=0.999 8。分别对方程中2个因子进行偏相关分析，其中X5的P均为0.0001，X1的P分别为0.022 8和0.000 1。

Y1=90.035 9-247.487 2X5-2.646 2X12；

(1)

Y2=22.495 6+2.797 8X1-96.488 9X5。

(2)

由2个回归方程可知，X1和X5为与因变量密切相关的主要诱导因子，说明NaCl和乙烯利对诱导土沉香结香起至关重要的作用，因X5的回归系数绝对值最大，充分说明乙烯利起主导作用。

方程(1)和(2)存在极大值，对其求极大值及其所对应的自变量值获得最适配比浓度，即Y1(max)=76.47 cm和Y2(max)=21.86%时，其最优处理组合为0.16%NaCl+0.21%乙烯利。

表2 不同处理下土沉香醇溶性浸出物含量

3 讨论

沉香是沉香属植物受刺激或损伤后产生的次生代谢物。受伤后的土沉香在形成沉香过程中，部分薄壁细胞内淀粉消失，使细胞液泡化而处于高渗状态，可溶性糖含量呈先升高后降低趋势(Nobuchietal.， 1991； 张兴丽， 2013； Sawetal.， 2014)。本研究中，随诱导时间增加，淀粉含量先降低后升高，可溶性糖含量先升高后降低，同时油脂类物质不断积累，与前人研究结果一致。从淀粉和可溶性糖含量变化可知，土沉香受到胁迫后，淀粉逐渐转化为可溶性糖。从可溶性糖含量升至最高值与淀粉含量降至最低值诱导时间不同可以推断，可溶性糖含量增加除受淀粉含量和转化速度影响外，还受其他物质的影响。处理2中淀粉和可溶性糖含量变化幅度最大，油脂类物质积累最多，说明该处理下土沉香的抗逆能力越强，其次生代谢能力也越高。采用可促进土沉香淀粉转化、可溶性糖含量增加的诱导剂，可能更有利于促进次生代谢物积累。

一些阔叶树当受到机械伤害、真菌侵染和病毒感染时，会产生防御反应，在边材导管中形成创伤性的侵填体和树胶(Leithetal.， 1999； Sunetal.， 2007)。本研究发现，未经处理的土沉香导管内未见任何形态内含物，射线薄壁细胞内含有大量淀粉粒，为木质部的储藏物质； 而经诱导处理后，射线薄壁细胞内淀粉粒减少，油脂类物质或侵填体在木薄壁细胞内积累。这些物质通过导管-薄壁细胞间半具缘纹孔进入相邻导管内累积、堵塞导管，证实土沉香射线薄壁细胞内含物的变化与沉香形成有密切关系(张兴丽等， 2012)的推断。

乙烯对萜类物质的释放与合成具有调控作用(刘娟， 2015； Royetal.， 2005)，在高盐胁迫下，乙烯信号途径中重要组分参与植物的盐胁迫反应(Leietal.， 2011； 赵赫等， 2016)。乙烯受体对高盐表现出抗性，其表达量受盐和乙烯协同诱导影响(Caoetal.， 2007； Heetal.， 2005)。本研究筛选出对土沉香结香起关键作用的诱导因子为NaCl和乙烯利，土沉香受盐胁迫的同时，乙烯利被水解为乙烯，可能启动乙烯信号途径，树体抵御高盐胁迫能力增强，次生代谢能力提高，从而促进沉香中脂类和倍半萜物质积累，与王之胤(2013)研究乙烯利诱导促进土沉香脂类物质形成以及Saltveit(2000)研究乙烯作为信号分子对伤害诱导后酚类物质合成研究的结论一致。今后将继续设置试验，验证因子理论最优组合的实际诱导效果，并在此基础上设计不同浓度乙烯利与NaCl配比混合液试验，验证在不同浓度盐胁迫下乙烯信号分子的响应强度，进一步确定对萜类物质的合成协同诱导作用。

激发子指能诱导植物起防御反应的分子，如乙烯、H2O2、水杨酸等，某些金属离子，如Ca2+、Mg2+等也具有激发子的功能(Vasconsueloetal.， 2007)。对比本研究中的处理5和4，其差别为是否添加CaCl2或乙烯利。添加CaCl2的处理在第3个月时，木芯横向变色较快，纵向变色缓慢； 第6和10个月时，木芯横向与纵向变色几乎没有增加； 可溶性糖含量在处理6个月时达到最大值，但升幅最小，油脂类物质含量最低。这说明Ca2+可能在诱导结香初期起作用，诱导结香效果较差。而添加乙烯利的处理在第3个月时，木芯横向和纵向变色缓慢，诱导效果不明显，但在第6和10个月时，木芯变色加快，升幅增大； 升至峰值时，可溶性糖与油脂类物质含量相对较高，综合结香效果较好。这说明乙烯利可能在后期激活诱导结香起作用，更能促进结香。后续可以继续加深Na+、Ca2+和乙烯利之间关系对沉香结香影响的研究。

4 结论

1) 促进土沉香结香的主要诱导因子为NaCl和乙烯利，其中乙烯利起主导作用，理论上诱导土沉香结香的最佳因子组合为0.16%NaCl+0.21%乙烯利。

2) 5种诱导处理中，以0.5%NaCl+1.5%FeSO4+0.1%CaCl2+0.01%茉莉酸甲酯+0.05%乙烯利诱导效果最好，处理10个月时醇溶性浸出物含量最高，达19.07%。

3) 结香油脂先在薄壁细胞内形成，随后在导管和薄壁细胞内积累， 导管内油脂物质积累与薄壁细胞内淀粉含量变化有关， 淀粉转化为可溶性糖的能力越强，油脂积累越多，越有利于结香。