金黄色葡萄球菌coa和saeRS基因对小鼠部分生物学指标的影响

刘 影，郭海勇，计银铎

(1.上海农林职业技术学院，上海201699；2.吉林师范大学生命科学学院，吉林 四平136000；3.明尼苏达大学 双城校区兽医学院，美国 明尼苏达州55108)

金黄色葡萄球菌是人和动物的一种重要致病菌，能引起各种感染，包括皮肤、软组织感染及全身感染，也是引起牛、羊乳房炎的重要病原菌之一。金黄色葡萄球菌的致病性主要归因于细菌产生的各种毒性因子，使细菌逃避机体的免疫系统而引发疾病[1-3]，而金黄色葡萄球菌的双组份信号转导系统saeRS是毒性因子的重要调节系统[4]，增强毒性因子hla(α毒素基因)、hlb(β溶血素基因)、hlgabc(γ溶血素基因)、lukED(杀白细胞素基因)和coa(血浆凝固酶基因)的转录和表达[5-7]。金黄色葡萄球菌毒素可损伤乳房上皮细胞[8]，促使牛、羊乳房炎发生。IL-17是一种刺激和介导机体产生炎性反应的信号分子，诱导炎性因子产生[9]、粒细胞生成和抵御细菌感染[10-12]，也是机体皮肤和粘膜抵御感染的免疫分子[13]。研究表明,IL-17在机体抵御金黄色葡萄球菌感染过程中起到关键性作用[14]。因此，试验旨在利用金黄色葡萄球菌saeRS及其相关基因coa突变菌株研究saeRS和coa基因对机体产生IL-17a的影响，探索金黄色葡萄球菌的致病机制，为临床预防和治疗牛、羊乳房炎提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与试验动物 金黄色葡萄球菌923(CA-MRSA)及其突变菌株923/coa、923/saeRS和923/coa/seaRS,各突变菌株特点如下：923/coa为敲除coa(血浆凝固酶)基因的菌株；923/saeRS为敲除saeRS(双组分信号转导系统)基因的菌株；923/coa/saeRS为敲除coa(凝血酶)和saeRS基因的菌株；Balb/c 雌性小鼠(上海吉辉试验动物饲养有限公司)，体重15～18 g。

1.1.2 主要试剂 IL-17a ELISA 检测试剂盒(Raybiotech)。

1.1.3 主要仪器与设施设备 SPF动物房及隔离包(上海农林职业技术学院SPF)，分光光度计(T-6 北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 小鼠饲养管理 小鼠饲养于SPF实验动物房，温度为25 ℃，12 h光照，自由采食和饮水。购入小鼠4 d后开始动物试验，试验期间每天固定时间称量体重，测量皮肤伤口面积，测量方法为：游标卡尺测量伤口的长度和宽度，长度乘以宽度计算出伤口面积。

1.2.2 细菌接种方法 细菌划线接种于TSA平板，37 ℃过夜培养。次日挑取单个菌落接种5 mL TSB培养基，37 ℃振荡培养过夜。翌日按1:100比例转接至 TSB培养基，37 ℃震荡培养至对数生长期。吸取1 mL细菌悬液于离心管中，离心，去除上清液，加入1mL PBS，吸打混匀，离心，去上清。再用PBS洗2次。细菌悬液用PBS稀释至107个/mL。小鼠随机分组，每组10只小鼠，背部剃毛、消毒，每只小鼠背部皮内注射100 μL细菌悬液。

1.2.3 血清制备和IL-17a检测方法 每天测量小鼠体重及背部形成伤疤面积。分别于感染后8 h、24 h、72 h和120 h摘眼球法采血，制备血清。按照Raybiotech公司提供的IL-17a ELISA检测方法检测小鼠血清IL-17a。

1.2.4 皮肤内细菌数测定 无菌条件下取细菌感染部位皮肤，称重，匀浆，PBS稀释104倍，涂布TSA平板，37 ℃培养过夜，次日菌落计数。

1.2.5 统计方法 用统计软件SPSS 16.0进行单因方差分析和Duncan法进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著。用数据统计软件SPSS 16.0 进行Pearson双尾相关性分析。

2 结 果

2.1 小鼠体重

小鼠经背部皮内感染菌株923及其各突变菌株8 h、24 h、72 h和120 h后，各组体重如图1所示。

感染细菌8 h后，923/coa/saeRS菌株感染组小鼠体重显著高于923/coa菌株感染组小鼠体重(P<0.05)；感染细菌24 h和72 h后，923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染组小鼠体重极显著高于923/coa菌株感染组小鼠体重(P<0.01)；感染细菌120 h后，923/coa/saeRS菌株感染组小鼠体重极显著高于923/saeRS菌株感染组小鼠体重(P<0.01)。

2.2 小鼠血清中IL-17a浓度

小鼠皮内感染细菌后8 h、24 h、72 h及120 h小鼠血清IL-17a浓度见图2。

小鼠皮内细菌感染后，每个试验组血清中IL-17a浓度逐渐升高，在24 h达到峰值，随后浓度逐渐下降。感染后8 h，野生型菌株923组小鼠血清IL-17a浓度低于突变菌株923/saeRS组小鼠血清IL-

17a的浓度，其中菌株923组和923/saeRS组之间的IL-17a浓度差异达到统计学显著(P<0.05)水平。感染后24～120 h，各试验组间小鼠血清IL-17a浓度无显著差异。

2.3 小鼠感染部位皮内细菌数

小鼠背部皮内感染菌株923及其各突变菌株72 h和120 h后，各组小鼠每克皮肤内细菌数如图3所示。

感染后72 h,923菌株感染组小鼠每克感染部位皮肤内细菌数极显著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染组(P<0.01)。感染后120 h,923菌株感染组小鼠每克感染部位皮肤内细菌数显著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染组(P<0.05)。

2.4 小鼠细菌感染部位伤疤面积

从图4可以看出，感染后8 h，各组小鼠在感染部位均未产生可测量伤疤。感染后24 h野生型菌株923组小鼠的伤疤面积显著高于突变菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的伤疤面积(P<0.05)；感染后72 h和120 h，野生型菌株923和突变菌株923/coa组小鼠的伤疤面积极显著高于突变菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的伤疤面积(P<0.01)。

2.5 血清IL-17a浓度与伤口面积的相关系数

各时间点血清IL-17a浓度与伤口面积间的皮尔逊相关系数见表1。由表1可以看出，感染后24 h血清IL-17a的浓度与感染后120 h小鼠感染部位伤疤面积的相关系数较强，并且达到极显著水平(P<0.01)。

表1 血清IL-17a浓度与伤口面积的皮尔逊相关系数Table 1 Correlation coefficient of IL-17a concentrationsand skin lesion size

3 讨 论

3.1 小鼠体重

从试验结果可以看出，突变菌株923/coa/saeRS感染组体重极显著高于923/coa和923/saeRS菌株感染组，923/saeRS菌株感染组小鼠体重极显著高于923/coa菌株感染组，说明突变菌株923/coa/saeRS的毒性低于923/coa和923/saeRS菌株，菌株923/saeRS的毒性低于923/coa菌株，这可能与saeRS基因控制较多毒性因子的表达有关[5-7]。

3.2 小鼠感染部位皮肤内细菌数

感染细菌后的第3天和第5天，小鼠每克感染部位皮肤内细菌数，923菌株感染组分别极显著和显著高于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株感染组，这可能是由于菌株923产生的毒性因子多于923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株，造成菌株923逃避机体免疫系统的能力最强，而923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株毒性减弱[1-3]，因此923菌株在感染部位的细菌数最多，923/coa、923/saeRS和923/coa/saeRS菌株在感染部位的细菌数减少。

3.3 小鼠血清中IL-17a浓度

感染后8 h，野生型菌株923组小鼠血清IL-17a浓度显著低于突变菌株923/saeRS组，这可能与923菌株产生的血浆凝固酶引发感染部位产生凝血，抑制细菌向周围扩散，从而降低感染初期血清IL-17a的浓度。

3.4 小鼠细菌感染部位伤疤面积

感染后8 h，各组小鼠在感染部位均未产生可测量伤疤。感染后24 h野生型菌株923组小鼠的伤疤面积显著高于突变菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的伤疤面积；感染后72 h和120 h，野生型菌株923和突变菌株923/coa组小鼠的伤疤面积极显著高于突变菌株923/saeRS和923/coa/saeRS感染小鼠的伤疤面积。上述试验现象可能与923/saeRS和 923/coa/saeRS菌株的毒力较弱，产生的毒素减少，免疫细胞产生的IL-17a也较少，不能有效介导机体的炎性反应，而很快被机体清除有关。突变菌株923/coa葡萄球菌血浆凝固酶直接受SaeRS调控[15]，野生型菌株923产生的血浆凝固酶，将无活性的凝血酶原转变为有活性的凝血酶，凝血后可以保护细菌不被免疫细胞吞噬，并形成免疫逃逸[1-16]，而且金黄色葡萄球菌还能产生抑制嗜中性粒细胞富集和吞噬功能的分子[2]，抑制炎性反应，所以在感染部位形成的伤疤面积小于923/coa感染组，血清IL-17a的浓度也低于923/coa感染组。

3.5 血清IL-17a浓度与伤口面积的相关系数

感染后24 h血清IL-17a的浓度与感染后120 h小鼠感染部位伤疤面积呈较强的正相关，因此，感染后24 h血清IL-17a浓度可作为检测和治疗金黄色葡萄球菌感染的参考指标。

4 结 论

Coa和saeRS基因影响菌株923的毒性，从而影响被感染小鼠体重、感染部位细菌含量、感染部位皮肤伤疤面积和血清IL-17a浓度。