乳果糖制备方法的研究进展

徐 铮，张 倩，李克文，徐 虹

（1.南京工业大学食品与轻工学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 211816；2.保龄宝生物股份有限公司，山东 禹城 251200）

乳果糖又名乳酮糖、异构化乳糖、4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖等（图1为结构式），是D-半乳糖基和D-果糖基以β-1,4-糖苷键连接而成的二糖（分子式C12H22O11，相对分子质量342.3），甜度是乳糖的1.5 倍，水溶性较好（室温下溶解度2.06 kg/L）[1-3]。

乳果糖天然存在于加热的牛乳中，但含量很低[4]。浓缩后的乳果糖糖浆可作为口服液治疗便秘和肝性脑病，相关机理为乳果糖进入人体后由于其特殊的β-糖苷键无法被分解吸收，经过胃和小肠后直达结肠，被益生菌发酵为短链有机酸（甲酸、乙酸、乳酸等）和二氧化碳，降低肠道pH值、提高渗透压、保留肠道水分、软化粪便产生润肠作用（图2）[5-6]。同时乳果糖能够促进双歧杆菌和乳酸菌，包括两歧双歧杆菌（Bifidobacteria bifidum）、长双歧杆菌（Bifidobacterialongum）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacteria infantis）、青春双歧杆菌（Bifidobacteria adolescentis）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）及保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）等的繁殖，抑制沙门氏菌、梭菌等有害菌的生长，实现肠道微环境平衡；在治疗肝性脑病时则能中和肝代谢异常产生的血氨，缓解病情；治疗便秘建议的乳果糖摄入量为每日10～40 g，而治疗肝性脑病可提高到每日90 g[7]。乳果糖在100多个国家作为非处方药（OTC）注册，已使用近70 年；其安全性非常高，即使大剂量服用也没有任何中毒、癌变、致畸的报道[8]。

市售乳果糖产品包括固体粉末和浓溶液2 种形式，但以浓溶液为主，为微黄色无异味的糖浆。药用乳果糖含量应为50～72 g/100 mL，此外还含有约20 g/100 mL的杂糖，包括乳糖（≤90 g/L）、D-半乳糖（≤150 g/L）、依匹乳糖（≤70 g/L）、D-塔格糖（≤30 g/L）和D-果糖（≤10 g/L）等[9]。各国药典对杂糖的含量均有极为严格的限定要求，因此在产品下游分离过程中对杂糖的监测和去除极为重要。天然存在的乳果糖含量极低，大量获取乳果糖需通过人工合成。早在1930年Montgomery等[10]就发现了化学制备乳果糖的方法，拉开了乳果糖的产业化序幕。此后乳果糖只能通过化学法进行合成，直到1978年Vaheri等[11]发现β-半乳糖苷酶可以催化乳糖和D-果糖生成乳果糖。在这以后，利用酶催化技术制备乳果糖的新工艺获得广泛关注。近年来又发现纤维二糖差向异构酶可以高效制备乳果糖，为乳果糖的生物法制备技术带来了希望。当前，全球主要的乳果糖制造商为苏威制药（现已被雅培制药并购）和森永乳业两大公司，其中苏威制药生产药用乳果糖口服液长达40 年（工厂设在荷兰和加拿大），占据一半以上市场（奥地利Fresenius Kabi公司占据剩余的部分市场）；而森永乳业主要生产食品用乳果糖，一般添加到婴儿食品或功能性食品中。2009年乳果糖的世界需求量已经达到每年5 万t，并呈快速上升趋势[2]；尤其在亚洲国家，由于老龄化问题加速了对乳果糖产品的消费需求，因此研究乳果糖的工业化生产具有重要意义。

本文针对近年来发表的乳果糖制备技术研究进展，分别对化学法、生物法以及乳果糖的下游处理技术进行总结与论述，以期为该领域研究提供借鉴。

1 化学催化法

化学催化法是目前乳果糖工业化生产的唯一方法，主要通过强碱环境下发生Lobry-de Bruyn-van Ekenstein转化，将乳糖中的葡萄糖基团异构为果糖基团，即形成乳果糖[12]。常用的碱包括氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、硼酸、偏铝酸钠、叔胺（三乙胺）、亚硫酸盐溶液、磷酸盐溶液等[13-15]，此外，呈碱性的海泡石[16-17]、碳酸钙[18]、鸡蛋壳等也具有催化能力[19]。尽管催化剂种类众多，但各有优缺点。例如，使用熟石灰（氢氧化钙）等催化剂转化率不高，一般不超过30%[10]；硼酸和偏铝酸钠的转化率较高（75%～85%），但会残留大量的硼离子或铝离子，且在中和反应中需要消耗大量的酸[13-14]。一般认为去除这些硼离子、铝离子需要昂贵的特种树脂，难以产业化。因此，现阶段的乳果糖制备方法仍依靠转化率较低的氢氧化钙法，其反应过程一般分为3 个阶段：第1阶段是乳果糖大量生成阶段；第2阶段是糖分解及副产物生成阶段，同时可见pH值下降及少量乳果糖生成；第3阶段是色素生成阶段，同时pH值接近中性[1]。分析反应产物可知，D-半乳糖是化学法工艺中较为常见的反应副产物，主要来自于乳糖和乳果糖的分解，此外还会产生少量D-果糖（乳果糖分解产物）和D-塔格糖（D-半乳糖异构产物）[1]。由于强碱环境下糖会发生褐变反应，故化学法易产生色素；一般通过活性炭或脱色树脂完成脱色，因此化学法所得乳果糖溶液呈微黄或黄色[4]。除脱色外，脱盐也是化学法必需的步骤，一般使用离子交换树脂实现[2]。俄罗斯一项专利（专利号No.2101358）[20]指出，可直接使用阴离子交换树脂（解离出OH-）催化乳糖获得乳果糖，同时达到脱盐目的，这为化学工艺发展提供了另一种思路。

2 β-半乳糖苷酶法

β-半乳糖苷酶即乳糖酶（EC 3.2.1.23），能够水解乳糖为D-葡萄糖和D-半乳糖，也具有转糖苷活性，可用于合成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶法是第1个被发现的乳果糖生物制备方法，即利用乳糖和D-果糖为双底物，通过β-半乳糖苷酶的转糖苷功能，释放1 分子D-葡萄糖后的半乳糖基团通过缩合D-果糖形成乳果糖，该反应的最终产物一般包括乳果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、残余D-果糖和乳糖，其中D-半乳糖和部分D-葡萄糖是由于酶的水解活性导致乳糖分解[2]。因此，该法制备乳果糖的得率较低（转糖苷活性小于水解活性），产品分离纯化难度大，产业化潜力不高。尽管如此，该法仍获得较多关注，包括嗜热古细菌（Pyrococcus furiosus）[21]、矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）[22]、米曲霉（Aspergillus oryzae）[23]、黑曲霉（Aspergillus niger）[24]、克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）[25]、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）[26]等来源的β-半乳糖苷酶均被尝试用于乳果糖的酶法制备。Lee等[27]利用体积分数50%乙醇透性化处理乳酸克鲁维酵母细胞（内含β-半乳糖苷酶），在60 ℃催化400 g/L乳糖，3 h内获得20 g/L乳果糖，生产强度为6.8 g/（L·h）。Kim等[22]利用大肠杆菌表达耐热型矿硫化叶菌（S. solfataricus）来源β-半乳糖苷酶，在80 ℃催化400 g/L乳糖，6 h内获得50 g/L乳果糖，生产强度为8.3 g/（L·h）。β-糖苷酶也被发现能够催化乳糖制备乳果糖，Mayer等[21]报道利用固定化的嗜热古细菌（Pyrococcus furiosus）来源耐热型β-糖苷酶催化乳糖，使用Amberlite IRA-93树脂做固定化载体，可获得52 g/（L·h）的乳果糖生产强度，底物转化率达43%，维持14 d以上活性无损耗。以上研究尽管对乳果糖的生产强度不高，导致实际生产成本高昂，但为酶法生产乳果糖的技术研发作了充分的理论铺垫。

3 差向异构酶法

差向异构转化广泛存在于糖类中，例如，D-葡萄糖转化为D-甘露糖、D-果糖转化为D-阿洛酮糖等，执行这类反应的酶也可以同时具有醛酮糖异构化能力，例如，纤维二糖差向异构酶（cellobiose 2-epimerase，CE酶，EC 5.1.3.11）既可以差向异构乳糖获得依匹乳糖，也可以醛酮糖异构化乳糖获得乳果糖[28-31]。Kim等[32]报道了利用CE酶催化乳糖制备乳果糖的工艺，使用150 U/mL纯化的嗜热纤维素降解菌（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）来源CE酶（CSCE），在80 ℃、pH 7.5条件下2 h内转化700 g/L乳糖，获得408 g/L乳果糖，转化率58%，生产强度高达204 g/（L·h）；同时也获得107 g/L依匹乳糖，转化率15%，生产强度54 g/（L·h）；因此总计74%的乳糖发生了转化。由于对乳果糖的生产强度较高，对高浓度底物催化效果好，而且CSCE酶在65 ℃的活性半衰期达到74 h，表现出很好的稳定性，因此具有工业化潜力[33]。后续又发现来自于嗜热细菌Dictyoglomus turgidum（DTCE）、嗜热网球菌（Dictyoglomus thermophilum）（DithCE）和嗜热细菌Caldicellulosiruptor obsidiansis（COCE）的CE酶也适合生产乳果糖（表1）[34-37]，其中DTCE酶催化乳糖的产物乳糖、依匹乳糖、乳果糖质量比为32.9∶12.8∶54.3[34]，COCE酶为35∶11∶54[37]。除这几类嗜热型CE酶外还发现了许多常温型CE酶，这类酶催化乳糖数小时几乎不产乳果糖，只生成依匹乳糖[38]，然而研究表明，这类酶在低温下进行长时间反应，最终也可以产生乳果糖，且各糖组分比例与嗜热型酶所得结果类似。但过长的反应时间造成生产强度大幅降低，因此常温型CE酶不具备工业化生产乳果糖的潜力[39]。

表1 已报道催化乳糖能够产生乳果糖的纤维二糖差向异构酶Table 1 Reported cellobiose 2-epimerases that produce lactulose

由表1可知，CE酶参与反应后会残留小部分乳糖，反应无法进行完全，而且会产生一定比例的依匹乳糖，依匹乳糖含量与乳果糖含量的比值一般为0.20～0.26，远超世界各国药典对依匹乳糖含量的限制性要求（小于0.07或0.10）[4]。因此，降低依匹乳糖含量是差向异构酶法亟待解决的问题，已报道方法主要利用定点突变技术。Park等[40]利用同源建模获得CSCE与配体的复合物结构后，确定Y114和N184 2 个位点对底物结合具有重要影响，尤其是底物糖环2号羟基位置，对2 个位点进行饱和突变研究发现：Y114位点绝大部分突变体均丧失了差向异构酶活性（除Y114F在37 ℃保留了7%的差向异构酶活性，65 ℃保留了26.4%的差向异构酶活性；Y114E在65 ℃保留了31.6%的差向异构酶活性），因此造成反应产物中依匹乳糖比例下降；Y114E催化200 g/L乳糖获得86.9 g/L乳果糖和4.6 g/L依匹乳糖，乳糖、依匹乳糖、乳果糖含量比为54.3∶2.3∶43.5，可见依匹乳糖含量与乳果糖含量的比值下降为0.05，但乳果糖产量也有所下降；针对N184位点的突变则导致总酶活下降过多，无应用价值；该研究结果表明，对CE酶活性口袋关键残基的定点突变可以大幅降低依匹乳糖产量。此外，在反应体系中添加硼酸也可以显著提升乳果糖的含量，并降低依匹乳糖比例。Kim等[41]将乳糖和硼酸以物质的量比1∶1加入CSCE酶后催化700 g/L乳糖，获得88%的转化率，乳果糖产量达到614 g/L，依匹乳糖含量低于20 g/L。但这种方法加入的硼酸仍偏多，在下游工艺中完全去除硼酸比较困难，因此实用性不强。

已报道CE酶在大肠杆菌中的表达形式均为胞内表达，利用表达CE酶的大肠杆菌（E. coli）重组菌进行全细胞催化能够获得与纯酶催化相类似的效率[42]。这是由于在较高反应温度下细胞易裂解，造成胞内酶逸出，自发解决了细胞膜对底物传质难的问题。然而采用纯酶或全细胞作为催化剂，在反应完成后难以回收。由于CE酶普遍具有较高的热稳定性，因此可以通过固定化酶或全细胞催化的形式实现催化剂的回收与重复利用。Wang Mingming等[43]将CSCE酶固定在商用的Duolite A568树脂（具有弱阴离子多孔结构）上，固定化前用70 ℃高温热处理2 h获得高纯度酶并与树脂静电吸附，用戊二醛交联后即获得固定化酶，此固定化酶在50 ℃条件下孵化12 h没有活力损失，在70 ℃条件下使用15 个批次保留90%酶活力，表明该方法具有实用性。Gu Junyan等[44]将CSCE酶固定化在枯草芽孢杆菌芽孢上，负载量为1.47 mg/1011个芽孢，负载率为79.4%，此固定化酶催化产生乳果糖的产量为395 g/L，转化率56.4%，生产强度98.75 g/（L·h），固定化芽孢反复催化8 个批次后残留70%的活力。本文总结了固定化酶法的工艺路线，并与全细胞催化法进行比较（图3），全细胞催化法因大量细胞的直接使用，以及细胞内容物逸出，必须经过多道工序实现蛋白质、脂类、核酸、色素、盐分的完全去除。相比较而言，固定化酶法仅需要通过膜过滤去除少量固定化材料上脱落的CE酶即可实现产品的纯化。而对于结合比较紧密的酶-固定化材料体系，脱落蛋白含量极少甚至不可检出，为产品纯化带来了巨大便利。因此，乳果糖的生物法制备工艺应以建立固定化酶反应体系为最终目标，从而大幅简化生产步骤，降低总成本。

由于大肠杆菌有内毒素分泌能力，而内毒素是一种热源，因此不适用于食品和药品领域的工业化生产。已有研究尝试使用多种食品级微生物宿主来表达CE酶，例如，毕赤酵母和枯草芽孢杆菌等。韩亮等[45]将CSCE酶基因经过密码子优化后克隆到pPIC9K分泌型表达载体，再引入到毕赤酵母GS115中表达成功，甲醇诱导144 h后摇瓶发酵上清液酶活为0.42 U/mL，证明CSCE酶在毕赤酵母GS115中的表达形式为分泌型，纯化后的重组酶与野生型酶性质接近，说明酵母宿主潜在的糖基化作用并没有对酶活性造成负面影响。将CSCE酶基因在食品级的枯草芽孢杆菌WB800中使用pMA09质粒表达，结果表明，在优化培养基后酶活力达到5.3 U/mL，主要为分泌表达形式，说明能够达到较高表达量水平；进一步将CE酶固定化为酶膜反应器，可重复催化10 个批次而未见酶活显著下降[46]。以上研究表明，CE酶具有在食品级宿主中表达并催化制备乳果糖的潜力，未来对这类宿主的高密度发酵进行研究以及对信号肽和启动子的筛选将进一步提高CE酶表达量，以期满足产业化需求并与食品、药品领域需求对接。

4 乳果糖纯化与结晶

乳果糖的分离纯化主要依靠色谱技术，主要分离对象为乳糖及其他杂糖。乳糖在低温下的溶解度较低[47]，因此可以通过浓缩降温结晶的方式除去大部分乳糖，剩余乳糖、杂糖、盐分均可以通过树脂实现有效分离。Dendene等[48]报道了利用阳离子树脂分离乳糖、乳果糖、D-半乳糖的方法，树脂选用Dowex AG50W-X8（K＋、Na＋或Ca2＋型），以纯水作为洗脱剂，成功建立了分离模型，结果表明，D-半乳糖容易分离，而乳糖与乳果糖的完全分离有一定难度；预测使用模拟移动床色谱可以实现大规模体系下乳果糖的高品质纯化。信成夫等[49]使用DTF-01 Ca2＋树脂加工乳果糖粗产品，设定料液质量浓度为500 g/L，分离温度60 ℃，洗脱液流速3.5 mL/min，在上述条件下能够将乳果糖含量从723.5 g/L提高到912.5 g/L。Julio-Gonzalez等[50]还利用商业化的β-半乳糖苷酶：环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）来源（Biolactasa®NTL*2）和两歧双歧杆菌来源（Saphera®2600 L）处理含有乳糖和乳果糖的反应液，结果表明，2 种β-半乳糖苷酶对乳糖和依匹乳糖的水解效率高于乳果糖，因此可将反应液中的乳糖和依匹乳糖水解为单糖，并进一步利用活性炭去除单糖，最终获得的乳果糖纯度大于94%，产品得率大于80%。为确保乳果糖分离过程的操作简便性，需开发快速的产物鉴定方法。刘芳等[51]建立薄层色谱法，展开剂为正丁醇-乙醇-水（体积比5∶3∶2），显色剂为苯胺-二苯胺-磷酸（2 g二苯胺、2 mL苯胺、5 mL 85%磷酸，溶于50 mL丙酮），能够较为便捷地区分乳糖、乳果糖及其他杂糖。固体形式的乳果糖为白色结晶粉末，易溶于水，微溶于甲醇，不溶于乙醚，熔点168.5～170.0 ℃[4]。利用甲醇可以促进高浓度乳果糖结晶，但乳果糖必须具有很高的纯度，乳果糖浓溶液黏度很大，这对结晶产生了较大的阻碍。也可以通过喷雾干燥的方式获得乳果糖固体粉末，但保存期短，极易吸潮。总体来看，结晶型乳果糖的制备难度较大，成本较高，浓溶液形式仍是乳果糖的主要保存方式。

5 结 语

乳果糖可以通过化学和生物法制备获得，比较2 种方法可得出以下结论：1）化学法在转化率上不占优势，但所用催化剂价格低廉、操作简便，仍是目前主流的乳果糖生产方法，并将持续使用一段时间；2）β-半乳糖苷酶法转化率低，实用价值较低。相比较而言，纤维二糖差向异构酶法更具潜力，该法的主要瓶颈在于副产物依匹乳糖含量的控制，以及酶催化活力偏低。可针对食品级宿主开展CE酶的高密度发酵研究，提升单位体积发酵液的总酶活；同时依托定向进化和理性设计2 条路线，建立高通量筛选方法和解析CE酶晶体结构，努力提高酶的比活力。此外，还可以根据近乎相同的手段来提升CE酶的热稳定性，使其在固定化后能够满足超高批次的循环利用，显著降低生物法的工艺成本。当生物法技术路线的成本接近甚至低于化学法时，生物法因其环保优势将彻底取代化学法。

由于我国老龄化问题不断严重，慢性便秘在人群中的患病率逐年走高。便秘在老年人中易导致排便过度用力而引发的急性心肌梗死、脑血管意外等危重疾病，长期使用酚酞、番泻叶、大黄等刺激型泻药又可能导致结肠黑病变，甚至不可逆的肠神经损害，因此乳果糖对老年人便秘病患较为友好[52]。另有研究表明，乳果糖对孕妇、儿童便秘也具有非常好的疗效[53-54]。随着大健康产业的蓬勃发展，肠道健康越来越受到人们的重视，乳果糖作为需求量较大的肠道类非处方药物，在未来具有持续增长的社会需求。另一方面，乳糖作为乳果糖的制备原料，本身是乳制品行业的一种废弃物，全球奶酪产业每年可产生120 万t乳糖，但其中的大部分未得到有效利用，部分企业将其排入环境中，引起水体富营养化污染[55]。乳果糖产业的发展将有效提升乳糖的利用率与附加值，并减少环境污染。生物技术在乳果糖的制备中扮演了重要角色，相信随着研发的不断深入，高品质、低成本的生物法会逐步取代化学合成法，使得乳果糖酶法制备工艺成为生物工程领域的又一个经典产业化案例。