乙酰左旋肉碱对大鼠脊髓损伤保护作用的实验研究

张梦洁 郭垚辉 任 彬 魏雅馨 崔 佳 沈 娟 杨彦玲 刘敏丽

延安大学医学院，陕西 延安 716000

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种严重的致残性疾病，由于外力直接或间接作用于脊髓引起其结构与功能损害，造成损伤平面以下脊髓神经功能障碍。在原发损伤的基础上，又会出现一系列复杂的病理生理变化，包括局部缺血缺氧、水肿、炎症反应、电解质改变、自由基产生、谷氨酸和天门冬氨酸等兴奋性氨基酸的释放及脂质过氧化等一系列病理过程[1-2]。乙酰左旋肉碱(acetyl-L-carnitine，ALC)是存在于体内的一种左旋肉碱的酯化产物，可穿过血脑屏障[3]。研究表明ALC可提高组织超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二酸(MDA)含量，增强抗氧化应激能力[4-6]，在脊髓损伤后乙酰左旋肉碱治疗可以改善线粒体功能，与显著的组织保留和功能恢复相关[7-8]。本实验旨在研究 ALC 对急性脊髓损伤后大鼠运动功能恢复的影响和神经元细胞形态、线粒体形态恢复的影响，为深入研究脊髓损伤后乙酰左旋肉碱对损伤脊髓的保护机制奠定理论基础。

1 材料和方法

1．1实验动物和主要仪器试剂SPF级SD大鼠72只，体质量(160±180 g)，雌性。购于西安交通大学医学院中心实验室，许可证号：SCXK(陕)2017-003。实验前将动物置于每天12 h∶12 h(光照∶避光)、安静、清洁、温度(20～22 ℃)、湿度45%～55%的实验动物房内适应性饲养2周，自由摄入食物、水。所有实验过程均经延安大学医学院实验动物管理伦理委员会批准进行。ALC(Sigma-Aldrich)、HI-0400脊髓打击器(美国PSI公司)、石蜡切片机2245(湖北徕克医疗)。多聚甲醛：天津化学试剂厂。苏木素伊红染液：温州康泰生物科技有限公司。

1．2改良Allen’s法大鼠SCI模型制备大鼠术前6 h禁食、水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉。以T10 棘突为中心作常规备皮、消毒、铺巾。沿脊柱方向作一2 cm 切口，逐层切开、分离组织，微型钳咬除T10棘突及椎板，暴露硬脊膜。固定大鼠于 HI-0400 脊髓打击器上，充分暴露脊髓 T10节段。打击力度 200 kdyn/cm2，致伤后大鼠随即出现双下肢、躯体扑动、强直，鼠尾摆动样表现，脊髓打击处迅速充血水肿。伤口逐层缝合，严格无菌操作。大鼠清醒后出现双后肢运动功能障碍，视为造模成功。

1．3大鼠分组给药及术后护理大鼠随机分为3组：脊髓损伤组(SCI 组) 、乙酰左旋肉碱组(SCI+ALC 组)、假手术组(Sham 组)，每组22只。

Sham组大鼠不打击脊髓，只进行椎板去除术，然后逐层缝合切口。ALC组在脊髓损伤模型建立后30 min腹腔注射给药乙酰左旋肉碱200 mg/kg，之后每天同一时间点给药1次，持续7 d。7 d 后每周给药1 次；持续至第 5 周；Sham组和SCI组相同时间点、相同体积生理盐水对照。大鼠术后单笼喂养，饲养环境温度保持在18～22 ℃，保持饲养笼内清洁、干燥，饮食不限量。术后连续3 d皮下注射50 000 U/支青霉素，1次/d。手术伤口消毒；挤压膀胱辅助排尿早中晚3次，直至膀胱功能恢复。过程中动物缺失立即相同条件下予以补齐。

1．4大鼠后肢运动评分及行为学观察术前2 d起分别由2名独立观察者(熟悉评分标准但非本组的实验人员)采用双盲法，将动物分别放置于直径为2 m的圆形平台上观察4 min，记录其后肢运动情况，采用BBB评分法[9]。并分别于术后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d对双后肢运动功能评分，每只大鼠的后肢体运动功能得分取2人评分平均值。

1．5灌流及取材分别于各组大鼠术后1、3 d，每组取3只，常规麻醉。大鼠取仰卧位，开胸后右心耳采血3 mL，3 000 r/min离心10 min后取血清置于 -20 ℃冰箱内保存。左心尖插入灌注针向上伸至升主动脉，动脉夹固定。4 ℃无菌生理盐水快速灌注至肝脏发白及右心耳流出液无色透明液体后，用4%多聚甲醛灌注至大鼠躯体僵硬。置于冰上解剖脊椎，以打击脊髓处为中点上下各取1.5 cm脊髓组织后进行外固定。乙醇梯度脱水后石蜡包埋，做5 μm厚切片，用于组织切片染色，苏木素-伊红染色后观察病理组织变化情况。

1．6透射电镜观察每组分别取3只大鼠于术后24 h心脏灌流取大鼠打击部分脊髓组织，包埋切片染色，用日本生产JEM1200型透射电镜观察。

每组分别取3只大鼠于脊髓损伤术后24 h，断头急性处死，冰上操作取脊髓组织修成1 mm×1 mm长条形，立即投于4 ℃预冷的2.5%戊二醛固定液。后续经过脱水、渗透、包埋聚合、切片、染色，透色电镜观察。

2 结果

术后护理过程中死亡4只，其中SCI组3只，药物组1只，在与之前造模相同条件下予以补充。

2．1BBB评分结果损伤前各组大鼠运动功能正常。损伤后1～3 d，SCI组和SCI+ALC组后肢运动功能恢复无明显区别。与Sham组相比，脊髓损伤组与乙酰左旋肉碱组大鼠后肢BBB评分明显降低(P<0.05)。损伤后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d乙酰左旋肉碱组评分均高于SCI组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。与Sham组相比，脊髓损伤组大鼠后肢BBB评分明显降低(P<0.05)；乙酰左旋肉碱组大鼠术后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d BBB评分均高于脊髓损伤组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2．2HE染色结果脊髓损伤后，打击处出现空洞，神经元坏死，神经纤维脱髓鞘，急性炎性细胞浸润。光镜下观察染色切片，Sham组第1天、第3天脊髓灰白质交界清楚，无出血及水肿灶，神经元丰富，细胞核结构完整，核仁清晰可见，无核固缩及坏死现象(图2A、D)。SCI组损伤后1 d，神经元内尼氏小体模糊，空洞周围神经元水肿变性，出血、炎性细胞浸润(图2B)。SCI组损伤后3 d，神经元死亡，有小胶质细胞围绕(图2E)。SCI+ALC组损伤后1 d，空洞周围神经元变性明显(图2C)。损伤后3 d，变性的神经元有好转，部分细胞结构逐渐清楚(图2F)。

2．3透射电镜观察结果手术后24 h电镜下观察，Sham组线粒体线粒体呈椭圆形，嵴与长轴平行或垂直，排列清楚。SCI组线粒体肿胀，呈椭圆形、不规则形或呈哑铃状，线粒体嵴碎裂，有空泡化，含量较少。

SCI+ALC组神经元细胞核结构清楚，核膜完整。胞浆内线粒体含量较多且结构完整，线粒体空泡化也较损伤组减轻。见图3。

图1 各组大鼠35 d的BBB评分变化 与SCI组相比，*P<0.05Figure 1 Changes in BBB scores of rats in each group at 35 days compared with SCI group，*P<0.05

表1 大鼠SCI后BBB评分 (分，

A：Sham组第1天；B：SCI组术后第1天；C：SCI+ALC组术后第1天；D：Sham组第3天；E：SCI组术后第3天；F：SCI+ALC组术后第3天图2 术后1～3天各组脊髓组织的HE染色(光镜10×40倍)Figure 2 HE staining of spinal cord tissues in each group 1-3 days after surgery(10×40 times)

图3 脊髓损伤后各组线粒体形态学观察(电镜×8 000) A：Sham组；B：SCI组；C：SCI+ALC组Figure 3 EM showing mitochondrial morphology after SCI(×8 000)．A：Sham group；B：SCI group；C：SCI+ALC group

3 讨论

随着社会经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈逐年增高的趋势[10]。创伤性脊髓损伤(SCI)对患者及其家属的身体、经济和社会心理健康均具有破坏性的影响。由于SCI独特的病理生理学特征，即最初的创伤性损伤(原发损伤)之后是继发的进行性损伤级联，其特征是缺血、促凋亡信号传导和周围炎性细胞浸润[11-12]。

随着促炎细胞因子和细胞毒性碎片(DNA、ATP、活性氧)的释放循环增加了损伤后的微环境[13]。病变发展到慢性期，周围的星形胶质纤维瘢痕的形成严重阻碍了神经组织的再生[14]。因此在脊髓损伤后早期，探究可能的干预措施对长期的功能恢复产生较大的影响。

线粒体作为细胞内一种高效的细胞器，其结构功能的正常是细胞进行氧化磷酸化、生成三磷酸腺苷的物质保障[15]。乙酰左旋肉碱(ALC)是左旋肉碱(L-Carnitine，LC)的主要乙酰酯，作为乙酰基的供体，在β-氧化过程中促进脂肪酸从细胞质转移到线粒体[16-17]。同时，ALC还具有抗氧化和抗凋亡作用，且对线粒体代谢有积极的作用[18]。急性脊髓损伤后，线粒体通过多种途径参与神经损伤，其中，氧化应激是导致神经细胞凋亡和脊髓功能障碍的重要原因之一，如果能抑制氧化应激反应将有效促进脊髓损伤的恢复。线粒体形态学的改变提示急性脊髓损伤后的线粒体功能的变化，MEYER等[19]发现线粒体在急性脊髓损伤后的继发性损伤中起重要作用。另有研究表明[20]，SCI后线粒体形态不规则，体积增大。线粒体嵴紊乱，损伤后2～24 h可见线粒体膜破裂。在继发性损伤中，线粒体功能的丧失会引起细胞死亡级联[21-23]，且有缺陷的线粒体不仅导致生物能量效率低下的细胞，而且还增加了ROS的生成，从而进一步导致组织氧化应激。而ALC能促进谷胱甘肽的生成从而促进活性氧清除酶的生成，保护线粒体酶免受氧化损伤。在氧化磷酸化过程中，ALC与长链脂肪酸通过线粒体内膜的运输密切相关。因此线粒体在维持细胞内钙稳态、细胞内信号传导、细胞器之间的联系、氧自由基的生成以及介导细胞凋亡中起重要作用[23-24]。

本实验在急性脊髓损伤后应用ALC，通过行为学纵横时间点的观察发现，损伤发生后，大鼠后肢瘫痪，运动功能丧失。随着损伤后时间的延长，后肢的运动功能逐渐恢复。相同时间点不同组别的比较发现，乙酰左旋肉碱可以提高急性脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复。这种疗效可能与乙酰左旋肉碱减轻了神经细胞和组织的损伤，促进了神经运动功能恢复的组织学基础相关。ALC作用后观察脊髓损伤部位的形态学，发现变性水肿的神经元结构逐渐清楚，细胞核清晰可见。进一步探究神经元胞体中线粒体结构的变化发现，损伤后24 h SCI组线粒体肿胀，呈椭圆形、不规则形或呈哑铃状，线粒体嵴碎裂，有空泡化，数目减少。应用ALC的治疗组，线粒体空泡化也较损伤组减轻，线粒体结构开始趋向完整。说明乙酰左旋肉碱能够减轻SCI后的继发性损伤，促进神经功能的恢复[25-26]。ALC通过对SCI后对线粒体的保护从而减轻继发性损伤给机体带来的危害，其机制可能与通过维持损伤后的线粒体稳态抑制神经元凋亡，促进了脊髓损伤后神经功能的恢复有关。为进一步研究ALC对线粒体的保护机制奠定了理论基础。

志谢本研究及学术论文是在我的导师刘敏丽副教授的亲切关怀和悉心指导下完成